免疫遺伝子の進化は黒死病と関連している

Jul 30, 2023

Nature volume 611、pages 312–319 (2022)この記事を引用

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感染症は、人類の進化を促進する最も強い選択圧の 1 つです 1,2。これには、有史以来最大の死亡率を記録した単一の出来事である、細菌ペスト菌によって引き起こされた、一般に黒死病と呼ばれるペストの第二次世界的大流行の最初の発生が含まれます3。このパンデミックはアフリカ・ユーラシア大陸を壊滅させ、人口の最大 30 ～ 50% が死亡しました4。黒死病の間に選択されていた可能性のある遺伝子座を特定するために、黒死病前、黒死病中、黒死病後の 2 つの異なるヨーロッパ人集団に由来する 206 の古代 DNA 抽出物から免疫関連遺伝子周辺の遺伝的変異を特徴付けました。免疫遺伝子座は、一連の非免疫遺伝子座と比較して高度に分化した部位が強く濃縮されており、ポジティブセレクションを示唆しています。ロンドンのデータセット内で高度に分化した 245 個のバリアントを特定し、そのうちの 4 個はデンマークの独立したコホートで再現されており、ポジティブセレクションの最も有力な候補となります。これらの変異体の 1 つである rs2549794 に対して選択された対立遺伝子は、完全長 (切断型ではなく) ERAP2 転写産物の産生、ペスト菌に対するサイトカイン応答の変化、およびマクロファージの細胞内ペスト菌を制御する能力の増加に関連しています。最後に、防御的変異が、現在自己免疫疾患に対する感受性の増加と関連している対立遺伝子と重複していることを示し、現在の疾患に対する感受性の形成において過去のパンデミックが果たした役割の経験的証拠を提供します。

感染症は、人間や他の動物の進化において最も強い選択圧の 1 つをもたらします 1,2。驚くべきことではないが、ヒトにおける集団特異的ポジティブセレクションの候補の多くには免疫応答遺伝子が含まれており、これは新規および/または再出現の病原体への曝露が適応を促進したという仮説と一致している。しかし、根本的な遺伝子座が現代の集団における同じ病原体に対する感受性と依然として関連していない限り、自然選択の特徴をその原因となる病原体と結び付けることは困難である7,8。人間の免疫系を形成してきたダイナミクスを解明することは、歴史的な病気が今日の病気の感受性にどのように寄与したかを理解する鍵となります。

私たちは、腺ペストの原因菌であるペスト菌によるヨーロッパ人における自然選択の痕跡を特定しようと努めました3。記録されている最初のペストのパンデミックは、西暦 541 年のユスティニアヌス帝のペストで始まりました (参考文献 9、10)。ほぼ 800 年後、黒死病 (1346 ～ 1350 年) はペストの 2 番目のパンデミックの始まりとなり、ヨーロッパ、中東、北アフリカ全体に広がり、人口が最大 30 ～ 50% 減少しました 4,11。最近ペストにさらされていないことから、黒死病の時代を生き延びたヨーロッパ人は、おそらくペスト菌に対するこれまでの適応がほとんどまたは全くなかった免疫学的にナイーブな集団を代表していたであろう。高い死亡率は、ペスト菌感染に対する防御を与える遺伝子変異がこの時期に強力な選択を受けていた可能性を示唆している。実際、ヨーロッパにおける第二のパンデミックのその後の400年間、ほぼ10年にわたるペストの発生は、しばしば（常にではないが）死亡率の低下と関連しており、これは病原体の進化や文化慣行の変化によるものである可能性があるが、潜在的には死亡率の低下と関連していた。ペスト菌に対するヒトの遺伝的適応と関連がある。

黒死病の流行中にペスト菌によって課された選択のゲノム標的が存在する場合、それは依然として解明されていない13、14、15。そのような遺伝子座をより正確に特定するために、我々は、ロンドンおよびデンマーク全土で黒死病の直前、最中、または直後に死亡した個人に由来する古代の DNA 抽出物の遺伝的変異を特徴付けました。この独自のサンプリング設計により、ペスト菌によるサインと、他の感染症または他の選択的プロセスに関連するサインを可能な限り区別できます (ただし、これらを完全に排除することはできません)。ロンドンから、互いに近い 3 つの墓地から個人がサンプリングされ、放射性炭素、層序、および歴史的記録によって黒死病前、黒死病発生中、黒死病発生後との日付が厳密に特定されました (図 1、補足表 1 および補足方法)。デンマークでは、地理的に全国に広がる 5 つの地域から個体が採取され、考古学的手段 (埋葬腕の位置など)、層序、および歴史的記録によって年代が特定されました。私たちはすべての個人を、黒死病前（ロンドン：紀元 1000 ～ 1250 年頃、デンマーク：紀元 850 年頃～1350 年頃）と黒死病後（ロンドン：紀元 1350 ～ 1539 年、デンマーク：紀元 1350 年頃～1350 年頃）に分類しました。広告1800年頃）。ロンドン市内では、イースト・スミスフィールドのペスト墓地に埋葬された人々も含めた。全員が1348年から1349年までの2年間の黒死病期間中に死亡した(参考文献16)。これらの個体のマイトゲノム多様性を分析すると、ヨーロッパのマイトゲノムハプロタイプのみが特定され、自然選択と非ヨーロッパ起源からの集団置換との間の混同の可能性が回避されます 17。

a、1348年から1349年にかけてのイースト・スミスフィールド黒死病集団埋葬地（ロンドン考古学博物館の許可を得て複製、著作権MOLA）。 b、ロンドン（ロンドン考古学博物館、参考文献48の後の挿入図）およびデンマーク全土からのサンプルの遺跡の場所と考古学的遺跡コード（括弧内）。 c、上、約6世紀にわたるロンドンの人口規模推定値（データは参考文献13、49、50からのもの）（補足表1）。下部は、サイトの場所と関連する日付範囲。色付きのボックスはサンプルの日付範囲を示し、ボックス内の数字は最終分析に含めるためのすべての基準を満たしているサンプルを示します（本文および補足情報を参照）。緑色の星の数字はイースト・スミスフィールドに由来し、破線は黒死病の時代を示しています。

合計 516 サンプル (ロンドンからは n = 318、デンマーク全土からは n = 198) を、シングルコピー核 c-myc 遺伝子の改良型ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) アッセイを使用してヒト DNA の存在についてスクリーニングし 17,18、360 サンプルを特定しました。下流の濃縮および追加の核遺伝子座の配列決定に十分な内因性 DNA 含有量を含みます (補足方法)。私たちのサンプルの多くは保存状態が悪く、内在性 DNA 含量が低いため、ハイブリダイゼーションキャプチャを使用して、356 個の免疫関連遺伝子、以前に免疫疾患に関連していた 496 個のゲノムワイド関連研究 (GWAS) 遺伝子座、および推定中立領域 250 個を濃縮し配列決定しました。 (それぞれ 1.5 kb)、Gronau ら 19 によって定義されています (補足表 2; 補足方法)。標的免疫遺伝子は、免疫関連プロセスにおける役割に基づいて手動で精選され、自然免疫受容体、主要な免疫転写因子、サイトカインとケモカイン、およびその他のエフェクター分子が含まれます (補足表 3)。脱アミノ化および他の形態の古代 DNA 損傷が偽の遺伝子型コールにつながらないことを確認するために、各シーケンス読み取りの開始と終了から 4 塩基対 (bp) をトリミングし (補足図 1)、すべてのシングルトンバリアントを除外しました (n = 106,757）。最終的なデータセットには、標的領域内に 33,110 個の二対立遺伝子変異体 (GWAS 遺伝子座近くに 2,669 個、免疫遺伝子に 19,972 個、推定中立領域に 10,469 個) が含まれており、平均カバー率は各部位あたり 4.6 倍のリードでした (個人ごとについては補足表 1 を参照)カバレッジ）。さらに、これらのサイトの50％以上で遺伝子型コールが欠落しているサンプルを除外し（n = 206個体を保持、図1c）、期間および集団あたり10人未満の遺伝子型コールを持つ変異体を除外することで、結果をフィルタリングしました。次に、遺伝子型の尤度を使用して、各時点での集団あたりのマイナー対立遺伝子頻度 (MAF) を計算しました。最後に、5％未満のバリアントの選択を検出する能力が非常に低いため、平均MAF（ロンドンとデンマークの平均）が5％を超えるサイトのみを保持しました（n = 22,868サイト）（補足図2）。

ペスト菌からの防御、またはペスト菌に対する感受性をもたらした可能性のある対立遺伝子を検出するために、候補領域 (免疫遺伝子および GWAS 遺伝子座) 内で、黒死病発生前と黒死病後のサンプル間で対立遺伝子頻度に予期せぬ大きな変化を示す変異体を検索しました。具体的には、同じ集団からサンプリングされた推定上の中立遺伝子領域の変異体と比較した場合に、分化度（FST）が偶然予想よりも大きかった対立遺伝子を特定しました。私たちはロンドンからの大規模なサンプルセットを発見コホートとして使用しました。また、ロンドンの埋葬はデンマークのものよりも年代が正確で、地理的に管理されており、ロンドンからのコホートにおける選択を検出する相対的な能力が向上しました（補足方法）。中立遺伝子座を使用して確立されたヌル期待と比較して、MAFが10％を超えるすべての周波数ビンで高度に区別されたバリアントが豊富であることがわかりました（図2a）。これらの変異体全体で、免疫遺伝子座での分化は、偶然に予想される率の 2.4 倍で中立変異体の 99 パーセンタイルを超えました (二項検定 P = 7.89 × 10−12)。 MAFが30％を超えるバリアントの場合、この濃縮はさらに顕著でした（偶然に予想される速度の3.9倍、二項検定P = 1.16×10−14）、おそらく検出力の増加によるものです（補足図2）。シミュレーションにより、中立遺伝子座と候補遺伝子座の間の組換え率とバックグラウンド選択の違いだけでは、観察された濃縮を説明するには不十分であることが示されました (拡張データ図 1)。ロンドンのサンプルからの免疫遺伝子座の間で観察された選択の兆候をさらに検証するために、デンマークのコホートから推定された対立遺伝子頻度を使用して同じ分析を実行しました。これらのサンプルは、中立遺伝子座からの予想と比較して高度に分化した部位も豊富であり（偶然予想される率の1.6倍、二項検定P = 9.21×10−4、図2b）、免疫におけるペスト誘発性選択の証拠をさらに裏付けています。遺伝子。

a、b、ロンドン (a) およびデンマーク (b) における黒死病 (BD) 前の集団と BD 後の集団を比較した場合の、中立領域と比較した機能領域の高度に分化した部位の濃縮。 c、黒死病前後のロンドン間のFST。自然選択と一致する質的パターンを示す535のサイトに限定（つまり、黒死病後のロンドンとデンマークの両方では対立遺伝子頻度が同じ方向に変化し、個人では逆方向に変化する）黒死病の流行中に死亡した人（補足表 4））。ポジティブ選択を示すパターンを持つ遺伝子座を示すマンハッタンプロット。点のサイズと色の濃さ (染色体ごとに交互) は、ペスト流行前後のロンドンの集団を比較した -log10 P 値を表します。オレンジ色の点は 4 つの位置とそれに関連する遺伝子を表しており、デンマークでも同様に高度に区別されています。 d – g、ポジティブセレクションの最も強い候補4つについて、時間の経過とともに変化する対立遺伝子のパターン。エラーバーは、その母集団からの個人と各時点の 10,000 回のブートストラップに基づく標準偏差を表します。ロンドンの対立遺伝子頻度は赤で示され、デンマークの対立遺伝子頻度は青で示されます。現代の対立遺伝子頻度は、ロンドンにあるイギリスの 1000 個のゲノムデータから導出されています51。

最も強力な選択候補を表す特定の遺伝子座を特定するために、この独自のデータセットの期間と集団を活用した一連の厳格な基準を適用しました。まず、ロンドンのみで黒死病前と黒死病後のサンプルを比較した場合、高度に分化した（中立部位を使用して定義された95パーセンタイルを超えるFST）245の一般的な変異体（MAFが10％を超える）を特定しました（補足表4）。次に、ペスト菌に対する感受性の増加、またはペスト菌からの防御をもたらす変異株は、黒死病の発生前、発生中、発生後に相反する頻度パターンを示すはずだと推論しました。具体的には、感受性と関連する変異は、黒死病中に死亡した人々の間で頻度が増加し、黒死病後にサンプリングされた個人（つまり、生存者および/または生存者の子孫）の間で頻度が減少するはずです。逆に、保護的なバリアントは逆のパターンを示すはずです。この推論を使用して、推定で選択された遺伝子座のリストを 245 から 35 に絞り込みました (補足表 4)。最後に、デンマークの複製コホートにおいて、これらの遺伝子座が黒死病の前後でも高度に分化しているかどうかを尋ねました（つまり、上位 10% の最も高度に分化した部位の中で、ロンドンで見られたのと同じ方向にあります）。 4 つの遺伝子座がこれらの基準を満たしており、選択の最も有力な候補を表しています (図 2c–g)。隠れマルコフモデル (HMM) フレームワーク (参考文献 20、補足方法に基づく) を使用して、これらの各バリアントの選択係数を計算しました。 4 つの候補遺伝子座間の非中立進化 (s ≠ 0) の統計的裏付けは、中立遺伝子座と比較した場合に強力です (各遺伝子座について P < 0.001; 補足表 5)。大きな信頼区間（数世代にわたって s を推定しようとする場合の固有の制限）にもかかわらず、s の点推定値の絶対値は 0.26 から 0.4 の範囲であり、これは私たちの知る限り、これまでに人間で報告されている中で最も強い選択係数の 1 つです (拡張データ図 2 および補足表 5)。

私たちのトップ候補バリアントはいずれもコーディングバリアントと重複しません（強い連鎖不平衡もありません）が、ERAP2 遺伝子の近くにあるバリアントの 1 つは、スプライシングに影響を与えるバリアントと強く関連しています 21,22。それらの選択的利点は、特にペスト菌感染に対する宿主応答に関与する免疫細胞タイプにおける遺伝子発現レベルへの影響に起因する可能性があります。特にマクロファージは感染部位に動員され、そこで細菌と相互作用し、ペスト耐性に寄与します23,24。マクロファージはペスト菌を貪食しますが、一部の細菌は生き残ってリンパ節に広がり、そこで制御不能に複製します 25,26。私たちが同定した 4 つの候補遺伝子座、またはその近くの遺伝子がペスト菌に対する転写応答に関与しているかどうかをテストするために、33 人から得た単球由来マクロファージを加熱死滅させたペスト菌とインキュベートし、その発現プロファイルを無刺激の対照と比較しました。 RNA シーケンスを使用したサンプル (補足方法)。予想通り、マクロファージはペスト菌に対して強力に反応したため、ベースラインとペスト菌の刺激条件を分ける遺伝子発現データの主成分 1 が全体の分散の 56% を説明します (拡張データ図 3)。

このデータセットでは、4 つの候補遺伝子座の 100 kb 内の 7 つの遺伝子が発現されました。遺伝子座 1 (rs2549794): ERAP1、ERAP2、LNPEP。遺伝子座 3 (rs11571319): CTLA4、ICOS; および遺伝子座 4 (rs17473484): TICAM2、TMED7。遺伝子座 2 (rs1052025) の 100 kb 以内にある唯一の遺伝子である NFATC1 は、このデータセットでは発現されませんでした。 LNPEPを唯一の例外として、これらの遺伝子はすべてペスト菌刺激に応答して差次的に発現し（図3a）、宿主応答におけるそれらの推定上の役割を裏付けています。生きた完全毒性のペスト菌に感染した8人の追加パネルからのマクロファージは、熱で死滅させた細菌に反応して観察されたものと同様の遺伝子発現方向の変化を示した。これは真のゲノム全体（r = 0.88、P < 1 × 10−10、拡張データ図4a）であり、4つの候補座位近くの遺伝子についても当てはまりました（ERAP1は例外です。生きた細菌に応答して上方制御されましたが、生菌では下方制御されました）熱で死滅させた細菌に対する反応、拡張データ図 4b)。遺伝子発現の変化がペスト菌に特有のものなのか、他の感染病原体と共通のものなのかを調べるために、生きたリステリア・モノサイトゲネス（グラム陽性菌）とネズミチフス菌（グラム陰性菌）に感染したマクロファージの遺伝子発現データを分析しました。ペスト菌）27、ならびにトール様受容体（TLR）経路（TLR1/2、TLR4、およびTLR7/8）および生きたインフルエンザウイルス28を標的とする細菌およびウイルスのリガンドで活性化された単球。これらのデータは、候補遺伝子座に近いすべての遺伝子 (CTLA4 を除く) が他の病原体に応答するが、発現変化の方向は刺激に応じて異なることを示しています。例えば、ERAP2は、ペスト菌を含むすべての生菌または細菌刺激に応答して下方制御されますが、ウイルス刺激に応答して上方制御されます（拡張データ図5）。

a、熱死させたペスト菌との初代マクロファージの4時間のインキュベーションに応答した、候補変異体の100kb内の遺伝子の正規化されたlog2倍率変化。濃い灰色の点は、テストした 33 人の各個人で観察された倍率変化に対応します。赤い点と棒は平均 ± 標準偏差を表します。 LNPEP を除いて、すべての関連性は有意です (誤検出率 10%)。 b、c、TICAM2発現に対するrs1747384遺伝子型の影響（b）およびERAP2発現に対するrs2549794遺伝子型（c）。加熱死滅させたペスト菌で4時間刺激したマクロファージと未刺激のマクロファージによって分割。赤い点と棒は平均 ± 標準偏差を表します。 d、ホモ接合性rs2549794遺伝子型を持つ個人におけるscRNA配列データを使用してプロファイリングされた、生きたペスト菌による5時間の非感染細胞と感染細胞間のERAP2発現の比較。色の強度は、刺激されていない細胞または感染した細胞について標準化されたERAP2発現レベルを反映します。主要な PBMC 細胞タイプはラベル付けされており、拡張データ図 7 で明確に色分けされていることがわかります。 CD4+ T 細胞と CD8+ T 細胞を別々に分析しました。 NK、ナチュラルキラー。 e、細胞型ごとの、感染条件と非感染条件に分けたERAP2発現に対するrs2549794遺伝子型の影響。 f、開始コドン（緑色）と停止コドン（茶色）を持つ、ハプロタイプAおよびハプロタイプBの2つのハプロタイプ特異的ERAP2スプライシング形態の図。以下に、ERAP2の総mRNA発現（左）およびERAP2の切断型をコードするアイソフォーム（ハプロタイプB）の特異的発現（右）に対するrs2248374遺伝子型の影響を示します。すべてのパネルについて: ***P < 0.001; **P < 0.01; *P < 0.05。

候補座位近くの遺伝子がマクロファージのペスト菌に対する転写反応を示すことを確立したので、次に、4つの候補座位のそれぞれにおける遺伝的変異が近くの遺伝子の遺伝子発現レベルと関連しているかどうかを尋ねました（図3b、c）。我々は、rs17473484 遺伝子型と TICAM2 発現との間に関連性があることを確認しました。この関連性では、防御対立遺伝子は、刺激を受けていない状態での遺伝子のより高い発現と関連していますが（図 3b; P = 2.5 × 10−6）、ペスト菌刺激後はそうではありません（P = 0.24）。 TICAM2 は TLR4 のアダプタータンパク質をコードしているため、この効果は興味深いものです。インビボでは、TLR4 は細菌の外膜上のリポ多糖類 (LPS) の認識を介してペスト菌を検出します 29。ペスト菌は、表面 LPS を脱アシル化することでこの検出を回避し、それによって TLR4 に対する結合親和性を低下させようとします (参考文献 30)。 TICAM2 は、LPS に結合した TLR4 をエンドソームに導き、I 型インターフェロン応答を活性化します 31。したがって、TICAM2 発現の増加は、LPS に対する感受性を高め、効果的な免疫応答を促進することにより、ペスト菌に対する防御を与える可能性があります。

私たちが特定した最も強い関連性は、rs2549794とERAP2発現の間であり、保護的対立遺伝子（C）は、非刺激の両方で、推定上の有害なT対立遺伝子と比較してERAP2の発現の5倍の増加と関連しています（P = 4.4） × 10−10）およびペスト菌で攻撃された細胞（P = 8.7 × 10−7）。他の病原体（サルモネラ菌、リステリア菌、インフルエンザ）に感染したマクロファージと単球、またはTLR活性化リガンドで刺激された単球でも同様に強い関連性が観察されました（すべてP < 1×10−10;拡張データ図6）。このパターンは、ペスト菌に感染した末梢血単核細胞 (PBMC) にもより広く一般化されており、感染/炎症刺激や細胞の種類に関係なく、rs2549794 が ERAP2 発現レベルと関連していることが示唆されます。詳細には、ベースライン時と生きた完全毒性 Y の感染後の両方で、10 人の個体 (選択的に有利な rs2549794 C 対立遺伝子のホモ接合体が 5 人、代替 T 対立遺伝子のホモ接合体が 5 人) の PBMC から単一細胞 RNA 配列データを生成しました。ペスト菌。プロファイリングされたすべての免疫細胞タイプ（B 細胞、CD4+ T 細胞、CD8+ T 細胞、ナチュラルキラー細胞および単球（拡張データ図 7））にわたって、ペスト菌の感染により遺伝子発現レベルが大幅に変化する 5,570 個の遺伝子が同定されました（314 個から 314 個まで）。細胞タイプあたり 4,234 個の遺伝子、誤検出率 10%; 補足表 6)。候補遺伝子座近くのほとんどの遺伝子は、ペスト菌感染に応答して差次的に発現しますが、そのような影響の大きさと方向は両方とも細胞型特異的です（拡張データ図 8）。たとえば、ERAP2は、すべてのPBMC細胞型で刺激により上方制御されますが（図3d、e）、単球由来マクロファージでは下方制御されます。これらの違いは、各細胞タイプで活性な転写因子とエンハンサーの違い、感染モデルの違い（PBMC 対単球由来マクロファージ）、またはその両方に起因する可能性があります。注目すべきことに、すべての細胞型およびすべての条件下で、選択的に優先される rs2549794 C 対立遺伝子は、代替の T 対立遺伝子と比較して ERAP2 発現の増加と関連しています。

ERAP2 遺伝子座は、世界中で共通する 2 つのハプロタイプ (A および B) によって特徴付けられます 21。ハプロタイプ A は、960 アミノ酸からなる標準 (全長) ERAP2 タンパク質をコードします。ハプロタイプ B は、2 つの未熟終止コドンを含む伸長したエクソン 10 を持つスプライスアイソフォームの生成につながる、スプライス部位変更変異体である rs2248374 の G 対立遺伝子の存在を特徴とします。この ERAP2 アイソフォームはナンセンス媒介減衰 (NMD) を受け、検出不能な ERAP2 タンパク質レベルをもたらします 21。ハプロタイプ B によってコードされる短いタンパク質は、生成されたとしてもアミノペプチダーゼ活性が制限されています 32。選択的に有利な rs2549794 C 対立遺伝子は、全長 ERAP2 タンパク質をコードするハプロタイプ A の rs2248374 (R2 > 0.8、D' = 1.0) の対立遺伝子 A と強く連鎖していますが、有害な rs2549794 T 対立遺伝子は rs2248374 と連鎖しています。 ERAP2の短縮型をコードするハプロタイプBのG対立遺伝子。ハプロタイプ B によってコードされる mRNA に特異的なリアルタイム PCR を使用して、マクロファージにおいて、有害な rs2248374 G 対立遺伝子を保有する個体における ERAP2 発現の低下が、NMD を起こすことが知られている短縮型アイソフォームのより高い発現と連動していることを発見しました (図 1)。 3f、P = 2.66 × 10−6)。エクソン 10 の PCR 増幅により、保護的 rs2248374 A 対立遺伝子のホモ接合である個体はハプロタイプ A のみを発現するのに対し、rs2248374 G 対立遺伝子のホモ接合である個体はほぼ独占的に切断型ハプロタイプ B を発現することが確認されました (拡張データ図 9)。

ERAP1 および ERAP2 は、主要組織適合性複合体 (MHC) クラス I 分子による CD8+ T 細胞への提示のためにペプチドをトリミングするために相乗的に機能するアミノペプチダーゼです 33。抗原提示におけるそれらの中心的な役割を考慮すると、rs2549794 を含むこれらの遺伝子付近の多型がさまざまな感染因子に対する感受性と関連していることは驚くべきことではありません 34,35。 ERAP2欠損は、エルシニア種由来のペプチド配列と高い相同性を有するMHCリガンドを含む、MHCによってCD8+ T細胞に提示される抗原レパートリーの大幅なリモデリングを引き起こします36,37。 ERAP2 媒介アミノペプチダーゼ活性を持つことは、CD8+ T 細胞に対するより多様なエルシニア由来抗原の提示を促進するのに役立つと考えられ、これは感染に対する防御に重要な役割を果たします 38,39。実際、CD8+ T 細胞を枯渇させたマウスは、より軽度のエルシニア属菌である偽結核菌に感染してから 1 週間以内にすべて死亡しますが、野生型マウスはすべて生き残ります 39。残念ながら、齧歯動物モデルはERAP1と相同なERAPアミノペプチダーゼを1つしか持たないため、生体内での抗原提示およびペスト菌に対する応答におけるERAP2の機能を直接試験する能力は限られている。

ERAP2 は、抗原提示と CD8+ T 細胞活性化における標準的な役割に加えて、ウイルスクリアランスとサイトカイン応答にも関与しています 40。したがって、我々は、ERAP2遺伝子型がペスト菌感染に対するサイトカイン応答の変動に関連しているかどうかをテストしようとしました。そのために、25 人から得たさらなる単球由来マクロファージセット（選択的に有利な ERAP2 ハプロタイプのホモ接合体が 9 名、有害なハプロタイプのヘテロ接合体が 9 名、有害なハプロタイプのホモ接合体が 7 名）に生きた毒性のペスト菌を感染させ、そのタンパク質レベルを測定しました。ベースラインおよび感染後 24 時間の免疫応答のさまざまな側面に関与する 10 個のサイトカイン。ベースラインではサイトカインレベルに差はありませんでしたが（すべて P > 0.05; 補足表 7）、4 つのサイトカインは刺激時に ERAP2 遺伝子型との有意な関連を示しました。具体的には、顆粒球コロニー刺激因子 (P = 0.0155)、インターロイキン (IL)-1β (P = 0.00262)、および IL-10 (P = 0.00248) のレベルは、防御 C 対立遺伝子の数とともに有意に減少しましたが、我々は、感染時の好中球の補充に関与するケモカインCCL3のレベルの反対のパターン（P = 0.0216）（図4a〜d;補足表7）。 ERAP2の機能とペスト菌に反応するサイトカイン応答の変動を結び付ける正確な機構はまだ解明されていないが、我々はそれが骨髄細胞の分化および/または活性化、および骨髄細胞の活性化においてERAP2が果たす役割によるものではないかと推測している。カスパーゼ 1/NLRP3 インフラマソーム経路の 40。最後に、ERAP2遺伝子型の関数として、内部移行したペスト菌の複製を制御するマクロファージの能力をアッセイしました。 ERAP2遺伝子型とペスト菌感染を制限する能力との間に相加的な関連が観察され、選択的に有利な対立遺伝子のコピーが多い個体ほど細胞内複製をよりよく制限できることがわかりました（スピアマンのrho = 0.42、 P = 0.0155;図4e）。。この実験は、ERAP2がペスト菌感染に対する応答に直接関係しているが、抗原提示におけるERAP2の標準的な役割以外の経路を介していることを示している。これらの結果を総合すると、黒死病の期間におけるERAP2対立遺伝子頻度の変化はおそらくペスト菌による自然選択によるものであるという考えが裏付けられる。

a〜d、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）（a）、インターロイキン-1β（IL-1β）（b）、インターロイキン10（IL-10）（c）およびCCモチーフのサイトカインレベルに対する遺伝子型の影響ケモカインリガンド 3 (CCL3) (d)。残りのサイトカインは有意な効果を示さず、補足表7に含まれています。 e、ERAP2遺伝子型（x軸）の関数として、24時間感染したマクロファージによって死滅した細菌の割合（y軸）を示す箱ひげ図。死滅した細菌のパーセンテージは、CFU2 h − CFU24 h/CFU2 h として計算されました。ここで、CFU はコロニー形成単位です。 P 値は、ERAP2 一塩基多型遺伝子型 (SNP) (各個人で見つかった保護的 rs2549794 対立遺伝子の数: 0、1、または 2 としてコード化) と死滅した細菌の割合との間の関連を調べる線形モデルから得られます。

私たちの結果は、黒死病がいくつかの免疫遺伝子座の周囲の遺伝的多様性を形成する重要な選択力であったという強力な経験的証拠を提供します。私たちが選択した候補遺伝子座はペスト菌だけでなく一般に病原体への反応に関与していますが、私たちの独自のサンプリング設計により、他の歴史的出来事（結核 8 や飢餓 41、42、43 など）が病原菌の推論に影響を与える可能性のある程度が最小限に抑えられました。選択。古代のゲノムデータを裏付けるために、インビトロ感染実験からの機能データを使用して、ポジティブセレクションの最も強力な候補がペスト菌に対する免疫応答に直接関与していることを確認しました。

私たちは、ロンドンでの黒死病の前後で強く区別され、デンマークのコホートで再現された 4 つの遺伝子座を、選択の最も強力な候補として特定しました。ただし、サンプルサイズが小さく、一部のサンプルのシーケンス深度が低いことを考慮すると、複製能力には限界があります。したがって、ロンドンの他の 245 の高度に分化した遺伝子座の一部も、おそらく自然選択の影響を受けていますが、保守的なフィルタリング基準には耐えられませんでした。サンプルサイズの増加と追加の機能データは、ペスト菌に対する免疫応答においてこれらの変異体が果たす進化的役割をさらに詳しく分析するのに役立ちます。

ERAP2は、遺伝的および機能的観点の両方から選択に対する最も説得力のある証拠を示し、推定選択係数は0.4でした（95％信頼区間0.19、0.62、拡張データ図2および10）。この推定値は、保護対立遺伝子のホモ接合型の人は、有害な変異型のホモ接合型の人よりも黒死病を生き延びる可能性が約 40% 高いことを示唆しています。この対立遺伝子は、ERAP2 の発現増加と標準的な完全長 ERAP2 タンパク質の産生の両方に関連しています 21,22。我々は、このタンパク質が CD8+ T 細胞に対するエルシニア由来抗原の提示を増加させ、ペスト菌に対する防御免疫応答を刺激することを示唆しています 38,39。さらに、選択されたERAP2対立遺伝子を有する個体のマクロファージは、ペスト菌感染に対する独特のサイトカイン応答に関与し、インビトロでペスト菌の複製をよりよく制限できることを示す。

一般に、選択的に有利なハプロタイプのコピーが多い個体は、感染に対するサイトカイン反応が弱いものの、細菌の増殖を制限する能力は優れていました。例えば、パイロトーシス性細胞死に関連することが多い重要な炎症誘発性サイトカインであるIL-1βのレベルは44、推定上の有害遺伝子型のホモ接合体と比較した場合、有利なERAP2遺伝子型のホモ接合体では3倍低かった。したがって、有利なハプロタイプを持つ被験者は、有害なハプロタイプを持つ被験者よりも、内部移行した細菌の制御とペスト菌による細胞死への抵抗の両方においてより効率的であり、感染時の傍観者の組織損傷を軽減するのに役立つ可能性があります。しかし、我々の実験はインビトロで行われたため、組織損傷、免疫細胞の動員および生存に対するERAP2遺伝子型の影響を直接評価することはできませんでした。

より広範には、我々の結果は、慢性炎症性疾患および自己免疫疾患に対する現在の感受性に対する自然選択の寄与を強調している。我々は、ERAP2がさまざまな病原体による刺激に転写反応し、免疫応答の制御における重要な役割を裏付けることを示した。したがって、ペスト菌によってERAP2に課せられた選択は、おそらく他の病原体または疾患形質に対する免疫応答に影響を与えると考えられます。この仮説と一致して、選択的に有利なERAP2変異体はクローン病の既知の危険因子でもあり45、ERAP2変異体は他の感染症とも関連している34,35。したがって、ペスト菌などの病原体存在下での病原体防御のための選択は、免疫疾患のコストと相殺される可能性があり、その結果、バランスのとれた選択の長期的な兆候が得られる21,22。同様に、別の最有力候補遺伝子座 (CTLA4 付近の rs11571319) は、関節リウマチ 46 および全身性エリテマトーデス 47 のリスク増加と関連しており、黒死病流行時に有利と推定される対立遺伝子を保持していると、現代の人々において自己免疫疾患のリスクが増加します。現在までのところ、自己免疫リスク対立遺伝子と過去の感染症への適応との関連性を示す証拠のほとんどは間接的なものにとどまっているが、これは主に選択を促進する病原体が隠蔽されたままであるためである。私たちの古代のゲノムおよび機能分析は、ペスト菌がそのような病原体の1つであったことを示唆しており、過去のパンデミックの選択力と現在の病気の感受性を結びつける経験的証拠を示しています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

古代の個体からのハイブリダイゼーション捕捉データは、BioProject PRJNA798381 の下で NCBI Sequence Read Archive (SRA) に保管されています。発現データは、プロジェクト GSE194118 (マクロファージ用) に基づいて NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) に、およびプロジェクトアクセッション PRJNA871128 (PBMC 用) に基づいて NCBI SRA に寄託されています。サイトカインのデータは補足表 8 に、CFU データは補足表 9 にあります。

すべてのデータ分析のスクリプトは、github.com/TaurVil/VilgalysKlunk_yersinia_pestis/ で入手できます。

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リファレンスをダウンロードする

建設的なコメントとフィードバックをくださったバレイロ研究室とポイナール研究室のメンバー全員に感謝します。コメントと原稿の編集をしていただいた J. Tung に感謝します。計算リソースはシカゴ大学リサーチコンピューティングセンターから提供されました。配列決定は、Farncombe Sequencing Facility McMaster University で行われました。この研究の実施を支援してくれたパスツール研究所のサイトメトリーおよびバイオマーカープラットフォームに感謝し、Luminex アッセイの実行を支援してくれた C. Petitdemange に特別に感謝します。中立進化下での対立遺伝子頻度変化のシミュレーションにご協力いただいた X. Zhang に感謝します。この研究は、LBB、HP、および JP-C への助成金 R01-GM134376、ウェナー・グレン財団から JFB への助成金 (8702)、および炎症性腸疾患学際研究センター (C-IID) によるシカゴ DDRCC によって支援されました。 ) (NIDDK P30 DK042086)。 SSHRC Insight Development Grant は、デンマークのサンプルの収集をサポートしました (430-2017-01193)。 HNP は、Insight Grant 番号によってサポートされました。人間とマイクロバイオームプログラムに基づき、カナダ社会科学・人文科学研究評議会 (SSHRC) およびカナダ高等研究所から 20008499 を取得しました。 TPV は NIH F32GM140568 によってサポートされました。 XC と M. Steinrücken は助成金 R01GM146051 によって支援されました。また、シカゴ大学ゲノミクス施設 (RRID:SCR_019196)、特に RNA シークエンシングへの支援については P. Faber に感謝します。 HP は、D. Poinar の継続的なサポートと原稿の提案と編集に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Jennifer Klunk、Tauras P. Vilgalys

この作品は次の著者が共同で監修しました: Hendrik N. Poinar、Luis B. Barreiro

マクマスター古代 DNA センター、人類学部、生物学および生化学学部、マクマスター大学、ハミルトン、オンタリオ州、カナダ

ジェニファー・クランク、キャサリン・イートン、G・ブライアン・ゴールディング、ヘンドリック・N・ポイナー

Daicel Arbor Biosciences、米国ミシガン州アナーバー

ジェニファー・クランク、アリソン・デヴォー、ジャン＝マリー・ルイヤール

シカゴ大学医学部遺伝医学部門（米国イリノイ州シカゴ）

トーラス・P・ヴィルガリス、白鳥マリー、マリア・I・パティーノ、アン・デュメイン、ルイス・B・バレイロ

エルシニア研究ユニット、パスツール研究所、パリ、フランス

クリスチャン・E・ドゥムール、ジュリアン・マデイ、レミ・ボー、ハビエル・ピサロ＝セルダ

シカゴ大学生態進化学部、シカゴ、イリノイ州、米国

チェン・シャオヘン & マティアス・スタインルッケン

米国イリノイ州レモントのシカゴ大学リケッツ研究所微生物学部

デレク・エリ & ドミニク・ミシアカス

人類生物考古学センター、ロンドン博物館、ロンドン、英国

レベッカ・レッドファーン

サウスカロライナ大学人類学部、コロンビア、サウスカロライナ州、米国

シャロン・N・デウィット

マニトバ大学人類学部、ウィニペグ、マニトバ州、カナダ

ジュリア・A・ギャンブル

デンマーク、オーデンセ南にある南デンマーク大学人類学部門法医学教室（ADBOU）

ジェスパー・L・ボールドセン

インディアナ大学歴史学部、ブルーミントン、インディアナ州、米国

アン・カーマイケル

ラトガース大学歴史学部、ニューアーク、ニュージャージー州、米国

ヌケット・ヴァルリク

モントリオール心臓研究所、モントリオール大学医学部、モントリオール、ケベック、カナダ

ジャン＝クリストフ・グルニエ

ミシガン大学化学工学部 - 米国、ミシガン州アナーバー、アナーバー

ジャン＝マリー・ルイヤール

Sainte-Justine University Hospital Center、モントリオール、ケベック、カナダ

ヴァニア・ヨトヴァ & レナータ・シンドー

カリフォルニア大学医学部リウマチ科、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州

チョン・ジミー・イェ & マーティン・ビカラン

カリフォルニア大学人類遺伝学研究所、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国

チョン・ジミー・イェ & マーティン・ビカラン

イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校、人類学部、米国イリノイ州アーバナ

ジェシカ・F・ブリンクワース

イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校、カール・R・ウースゲノム生物学研究所、米国イリノイ州アーバナ

ジェシカ・F・ブリンクワース

モントリオール神経研究所病院、マギル大学、モントリオール、ケベック、カナダ

ガイ・A・ルーロー

シカゴ大学人間遺伝学部、シカゴ、イリノイ州、米国

マティアス・スタインリュッケン & ルイス・B・スイーパー

マイケル・G・デグルート感染症研究所、マクマスター大学、ハミルトン、オンタリオ州、カナダ

ヘンドリック・N・ポイナール

人間とマイクロバイオームプログラム、カナダ高等研究所、トロント、オンタリオ州、カナダ

ヘンドリック・N・ポイナール

遺伝学、ゲノミクス、およびシステム生物学に関する委員会、シカゴ大学、シカゴ、イリノイ州、米国

ルイス・B・バレイロ

免疫学委員会、シカゴ大学、シカゴ、イリノイ州、米国

ルイス・B・バレイロ

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LBB と HNP が研究を指揮しました。 JK は濃縮アッセイを設計し、古代ゲノムデータを生成しました。 TPV がすべてのデータと計算解析を主導し、J.-CGXC の協力を得て、M. Steinrücken の監督の下で選択係数を推定するためのすべての解析を実行しました。 JFB、RS、および VY は、マクロファージと熱で死滅させたペスト菌を用いた攻撃実験を実施しました。 M. Shiratori と A. Dumaine は、DE、DMCED、および JP-C の支援を受けて、PBMC で感染実験を実施し、単一細胞 RNA 配列データを生成しました。 JMとRBCJYの支援を受けて、マクロファージ上で生きたペスト菌による感染実験を実施および設計し、サイトカインとCFUの両方のデータを生成しました。MBは、ERAP2の短縮バージョンをコードするアイソフォームを定量化するためのプローブを設計し、MIPが実験を実施しました。 RR、SND、JAG、JLB は、サンプル、年代測定を含む考古学的情報、その他の関連情報へのアクセスを提供しました。 AC と NV は歴史的背景についての洞察を提供しました。 KE と GBG は、追加のサンプリング、バイオインフォマティクス処理、およびクラスターのメンテナンスを提供しました。 A. Devault と J.-MR は、標的を絞った濃縮と、免疫濃縮に使用される餌の修正バージョンに関する洞察を提供しました。 GAR は遺伝子座に関するゲノム情報を提供し、標的の配列決定に財政的に貢献しました。 TPV、JK、HNP、LBB がすべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

ヘンドリック・N・ポイナールまたはルイス・B・バレイロとの通信。

JK、A. Devault および J.-MR は、この研究のために myBaits ハイブリダイゼーションキャプチャキットを提供した Daicel Arbor Biosciences への金銭的利益を宣言しています。他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた M. Thomas P. Gilbert と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

中立遺伝子座と候補領域間の組換え率 (A) とバックグラウンド選択レベル (B) の比較。候補領域は、BD 前と BD 後のロンドンでの高度な分化に基づいて、テストされた領域とポジティブセレクションの候補となる領域に層別されました。 (C) 我々の研究で対象とした領域の組換え率とバックグラウンド選択を一致させた順方向シミュレーションでは、候補領域内の高度に分化した部位がわずかに濃縮されているが、収集したデータ (D) で観察された濃縮レベルとは程遠いことが示されています。比較のために図 2a から。たとえば、免疫遺伝子座でのデータの区別は、偶然に予想される率の 2.4 倍で中立変異体の 99 パーセンタイルを超えましたが (MAF > 10% の変異体の間で)、シミュレートされたデータでは同じ濃縮度は 1.2 倍未満です。

(A) 初期条件として対応するブートストラップされた対立遺伝子頻度分布とブートストラップ補正された推定値を使用して複製をシミュレートした場合の、4 つの SNP の \({\hat{s}}_{{\rm{MLE}}}\) の分布 \ ({\widetilde{s}}_{{\rm{MLE}}}\)。バイオリンプロット上のひげは、それぞれの分布の 2.5、50、および 97.5 パーセンタイルにラベルを付けます。 (B) ROC および (C) 選択下の反復と中立下の反復を区別するための推定手順の適合率 - 再現率曲線。

最初の主成分は、刺激されたサンプルを対応するコントロールから明確に分離します。

加熱死滅させたペスト菌（x 軸、n = 33 個体）と生きたペスト菌（y 軸、n = 8 個体）の間で比較したペスト菌刺激の効果量。 (A) はすべての遺伝子を示し、青い線は最良の適合線 (r = 0.88) を表します。 (B) は、両方の発現データセットでプロファイリングされたポジティブ選択の候補に近い遺伝子でのエフェクトサイズを比較しています (赤: 加熱死菌、紫: 生菌)。エラーバーは、効果の大きさを推定する際の標準誤差を表します。効果の方向は、LNPEP (どちらの分析でも有意ではない) と ERAP1 を除いて一貫しています。 CTLA4 と TICAM2 は、生きたペスト菌に感染した 8 人のマクロファージでは十分に高いレベルで発現されなかったため、表示されていません。各値の点推定値の近くに配置されたアスタリスクは、有意性を表します: *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05。

データは Nedelec らから得られます 27。およびQuachら28、Nedelecら。は、2 つの生きた細胞内細菌、リステリアモノサイトゲネス (グラム陽性菌) とネズミチフス菌 (グラム陰性菌) の感染に対する単球由来マクロファージの遺伝子発現応答を測定しました。クアックら。は、Toll 様受容体経路 (TLR1/2、TLR4、および TLR7/8) および生きたインフルエンザウイルスを活性化する細菌およびウイルスの刺激リガンドに対する初代単球の 6 時間の転写応答を特徴付けました。ペスト菌のデータは、熱で死滅させた細菌に応答して観察された倍数変化応答です。プロット内の負の推定値 (紫) は遺伝子がダウンレギュレートされていることを示し、正の値 (赤) は遺伝子がアップレギュレートされていることを示します。報告された変更の統計的裏付けは、関連する p 値によって与えられます。円のサイズが大きいほど p 値が小さいことを表し、空の円はそのデータセットで遺伝子が発現されなかった場合を示します。

この研究および以前に発表された実験条件にわたる、ERAP2 (上) および TICAM2 (下) の発現に対する近くの遺伝子座の遺伝子型の影響。 ERAP2 の場合、保護的な「C」ハプロタイプはすべての条件で発現を増加させます (p < 0.001)。 TICAM2 の場合、保護参照ハプロタイプは非刺激条件でのみ発現を減少させます (p = 2.5x10−6; 他のすべての条件では p > 0.05)。

サンプルを統合した後の、非感染細胞および生きたペスト菌に5時間感染した細胞の単一細胞RNA配列データのUMAP投影。主要な免疫細胞タイプは個別にクラスター化されており、細胞は割り当てられた細胞タイプによって色付けされます。

単一細胞 RNA シーケンスを使用してプロファイリングされた各細胞タイプについて、遺伝子発現に対するペスト菌感染の影響を示します。負の推定値 (紫) は遺伝子がダウンレギュレートされていることを示し、正の値 (赤) は遺伝子がアップレギュレートされていることを示します。報告された変更の統計的裏付けは、関連する p 値によって与えられます。大きい円サイズは小さい p 値を表し、白丸はその細胞型で遺伝子が発現されなかった場合を示します。

スライスバリアント rs2248374 の異なる遺伝子型を持つ 10 人のマクロファージからのエクソン 10 スプライスジャンクションを横切る cDNA の PCR 増幅の結果を示すバイオアナライザートレース。各個体の遺伝子型が上部に表示されます。ネガティブ PCR コントロールも水を使用して実行されました。 rs2248374 の G 対立遺伝子は、2 つの未熟な終止コドン (赤い四角形) を含む伸長したエクソン 10 を生成し、ナンセンス媒介崩壊を引き起こすと予測されています。

時間軸は、経験的サンプルの相対サンプリング時間のおおよその基準として機能します。垂直の破線は、分析で考慮されたサンプルの各グループの相対サンプリング時間を示し、オレンジ色と青色の点が付いた浮動ボックスは、両対立遺伝子座からのサンプルのプールを表します。時間軸の上と下は、それぞれシミュレーションスキームと尤度計算に対応するスケッチです。影付きの赤い水平ツリーは、おおよその時間 (x 軸) に沿った人口の継続性を表しており、黒死病のパンデミックは暗い影付きの期間に発生しています。先端に頭蓋骨が付いた短くなった枝は、この病気で亡くなった人々を表しています。シミュレートされた各反復において、Δp と -Δp は、パンデミック中期およびパンデミック後のサンプルプールにおけるパンデミック中の対立遺伝子頻度のそれぞれの変化をマークします。推論図では、各水平直線は、尤度が計算されたサンプリングスキームを表します。 s または -s のラベルが付いた稲妻は、選択係数を表します。

補足方法、参考文献、図 1 (古代のゲノム損傷の補正)、図 2 (黒死病に対する防御対立遺伝子を特定する力)、図 3 (各ターゲット SNP の選択係数 s の関数としての対数尤度)図 4 (4 つのターゲット SNP のパンデミック前の頻度から始まるシミュレーションデータの \({\hat{s}}_{{\rm{MLE}}}\,\) の分布)。

補足表 1 (古代 DNA 分析のためにサンプリングされた個体)、表 2 (エクソン、GWAS、および中性餌の設計に使用される遺伝子座)、表 3 (エクソン捕捉で標的とされる hg18 の位置)、表 4 (高度に分化した変異体)、表 5 (推定値)表 6 (ペスト菌刺激後の遺伝子発現の変化)、表 7 (サイトカインの結果)、表 8 (サイトカインのデータ)、表 9 (コロニー形成単位のデータ)、および表 10 (ERAP2 間の相互作用効果)遺伝子型とペスト菌の刺激）。

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転載と許可

Klunk, J.、Vilgalys, TP、Demeure, CE 他免疫遺伝子の進化は黒死病と関連しています。 Nature 611、312–319 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05349-x

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受信日: 2022 年 1 月 12 日

受理日: 2022 年 9 月 14 日

公開日: 2022 年 10 月 19 日

発行日: 2022 年 11 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05349-x

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