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ストレス
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Communications Biology volume 6、記事番号: 602 (2023) この記事を引用
367 アクセス
4 オルトメトリック
メトリクスの詳細
統合ストレス応答 (ISR) は、主に全体的な翻訳停止と細胞の適応に関連する分子の上方制御を通じて、細胞ストレス応答において極めて重要な役割を果たします。 成長分化因子 15 (Gdf15) は、さまざまな種類の疾患における臨床炎症および代謝障害の強力なストレス応答性バイオマーカーです。 ここでは、ISR 駆動の細胞ストレスが Gdf15 を調節することによって病態生理学的結果に寄与するかどうかを評価します。 臨床トランスクリプトーム分析は、PKR が腎損傷患者における Gdf15 発現と正の関連があることを示しています。 Gdf15 の発現は、マウスの急性腎腸障害時のプロテインキナーゼ R (PKR) 関連 ISR に依存しており、Gdf15 の遺伝的除去は腎組織および腸関門における化学物質誘発性病変を悪化させます。 腸内細菌叢の詳細な評価により、Gdf15 が豊富なムチン代謝関連細菌およびその酵素と関連していることが示されています。 さらに、ストレス応答性 Gdf15 は、オートファジー制御ネットワークの再構成を介してムチン産生と細胞生存を促進します。 まとめると、ISR 活性化 Gdf15 は、オートファジー ネットワークと微生物群集の保護的再プログラミングを介して病理学的プロセスに対抗し、それによって腎腸障害に対する強力な予測バイオマーカーと介入を提供します。
腎腸障害は、腸と腎臓の間の有害な臓器間コミュニケーションの病理学的結果です。 蓄積されている証拠は、胃腸管が微生物および免疫関連細胞の主要な供給源であり、急性腎障害 (AKI) または慢性腎臓病 (CKD) の患者に炎症性傷害を引き起こすことを示唆しています 1,2,3。 同様に、腎尿細管損傷、腎結石症、尿細管間質性腎炎、糸球体腎炎、アミロイドーシスなどの腎臓症状が、炎症性腸疾患などの腸管バリア障害を患う患者の 4 ~ 23% で報告されています 4,5,6。 実験的には、進行性CKDは腸粘膜バリアの損傷とその後の全身性炎症を引き起こし、それによって疾患の重症度を悪化させる可能性があることが示されています3。 特に、菌血症または内毒素血症のレベルは、CKD 患者の疾患の重症度と高度に関連しています 7,8。 有害な微生物叢、エンドトキシン、尿毒症毒素などの腸由来の有害因子が腎障害の原因となります9。 腎腸障害のもう 1 つの代表的な臨床モデルは、化学療法誘発性合併症です 10,11 が、シスプラチン (CP) などのプラチナベースの化学療法剤は、固形腫瘍や血液悪性腫瘍の治療に広く使用されています 12。 6年間のコホート調査によると、CP化学療法を受けたさまざまな種類のがんを患う成人患者の約34%がAKIを経験しており、ほとんどの患者は推定糸球体濾過量のわずかではあるが永続的な低下などの長期的な腎転帰を示していることが判明した。レート(eGFR)13. 腎損傷に加えて、化学療法は粘膜炎の誘発にも関連しています14。 抗がん剤の有益な効果にもかかわらず、固形腫瘍患者の 20 ~ 40% が抗がん剤治療後に粘膜炎を発症すると報告されています 15。 口、胃、腸の粘膜などの急速に成長する細胞や組織は、遺伝毒性ストレッサーを介して抗がん剤によって媒介される有害な作用の主な標的です16。
成長分化因子 15 (Gdf15) は、トランスフォーミング成長因子 (TGF)-β スーパーファミリーのメンバーであり、組織損傷、炎症、発癌性損傷などのさまざまな病理学的刺激によって誘導されます 17、18、19。 蓄積された証拠に基づくと、Gdf15 は細胞の恒常性応答に関与し、慢性炎症や腫瘍形成などの生理学的状態と病理学的状態の両方で保護的な役割を果たしています 20、21、22、23。 Gdf15 の組織発現レベルが Gdf1524 の分泌レベルと強く相関していることを考えると、循環 Gdf15 レベルは組織損傷を表す可能性があります。 注目すべきことに、血中 Gdf15 レベルは、CKD24、25、26 を含む、加齢や病気の進行に伴う腎機能障害や損傷と正の相関関係があります。
多様な内部および外部ストレス因子に応答して、真核細胞は共通の適応経路である統合ストレス応答 (ISR) を活性化し、細胞の完全性を回復します。 ISR における中心的な生化学的事象は、eIF2α キナーゼファミリーによる真核生物の翻訳開始因子 2 α (eIF2α) のリン酸化であり、これにより全体的な翻訳停止と、生物学的恒常性を達成するための特定のストレス応答性遺伝子の誘導が引き起こされます 27,28。 本明細書では、ISRによる細胞ストレスが腎腸障害時のGdf15の調節を介して病態生理学的転帰に寄与するかどうかを調べた。 Gdf15 が組織損傷に関連するストレス応答性分子であるという仮定に基づいて、臨床トランスクリプトームおよび動物損傷モデルを使用して腎腸障害における Gdf15 の作用が予測されました。 腎臓への有害な転帰に加えて、腸と腎臓の間の複雑な器官間コミュニケーションにおいて、微生物群集や腸上皮バリアなどの粘膜特異的ニッチが取り上げられました。 私たちの発見は、腎腸障害の予後と介入についての新たな洞察を提供するでしょう。
ISR関連細胞プロセスが腎窮迫の調節に関与しているという仮定に基づき、4つの包括的なストレス関連哺乳類eIF2αキナーゼ、すなわちEIF2AK1 (HRI)、EIF2AK2 (プロテインキナーゼR; PKR)、EIF2AK3 (プロテインキナーゼR)の発現様小胞体キナーゼ;PERK)、およびEIF2AK4 (GCN2)をAKI患者において比較した(図1a)。 EIF2AK2 (PKR) の発現は、他の哺乳動物 eIF2α キナーゼの発現レベルと比較して顕著に上昇しました。 臨床トランスクリプトームに基づく分析により、AKI または CKD 患者は PKR レベルの上昇を示すことが明らかになりました (図 1b、c)。 PERKレベルはAKI患者では有意に上昇しなかったが、CKD患者ではレベルの上昇が観察された(補足図s1a、b)。 また、臨床ゲノムデータセット (それぞれ GSE30718 および GSE66494) におけるヒト AKI および CKD に関連する Gdf15 発現も分析しました。 AKIおよびCKD患者ではGdf15の相対発現が対照群よりも有意に高いことが観察されました(それぞれ図1d、e)。 さらに、PKRまたはその代表的な標的であるC/EBP相同タンパク質(CHOP)のレベルが上昇している被験者は、PKRまたはCHOPの発現が低い被験者よりも高いGdf15レベルを示す傾向がありました(図1f [AKI]および1 g [CKD])。 、したがって、PKR シグナル伝達と Gdf15 発現の間に正の関連があることが示されます。 対照的に、PERK発現は、AKIまたはCKD患者のGdf15レベルと有意な関連はありませんでした(それぞれ補足図s1c、d)。
a eIF2α キナーゼ遺伝子 (EIF2AK1、EIF2AK2、EIF2AK3、および EIF2AK4) の発現レベルを、急性腎障害 (GSE30718) の各患者で比較しました。 b–e PKR(b、c)またはGdf15(d、e)の発現は、急性腎損傷(GSE30718、bおよびd)または慢性腎臓病(GSE66494、cおよびe)を含む腎損傷患者で測定されました。 結果は、Tukey ひげを含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) は 2 つのグループ間の有意差を示します (*p < 0.05、***p < 0.001)。 f – g PKRまたはC / EBP相同タンパク質(CHOP)レベルに基づいて、最高レベルの20サンプルと最低レベルの20サンプルを選択し、急性腎損傷(GSE30718、GSE30718、 f) または慢性腎臓病 (GSE66494、g)。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) はグループ間の有意差を示します (対応のない両側スチューデント t 検定を使用した場合、*p < 0.05、**p < 0.01)。 h – i コントロール(ネガティブコントロールshRNA)またはshPERKまたはshPKRプラスミドをトランスフェクトしたHK-2細胞(h)およびHCT8細胞(i)を、ビヒクルまたは10μmol/Lシスプラチン(CP)で48時間処理しました。 細胞溶解物をウェスタンブロット分析に供しました。 eIF2α、真核生物開始因子 2 アルファ。 Gdf15、成長分化因子 15; PKR、プロテインキナーゼR; PERK、プロテインキナーゼ様小胞体キナーゼ。
Gdf15 は、腎腸障害時のプラチナ曝露に応答したストレス誘発因子として機構的に評価されました。 臨床トランスクリプトーム評価と一致して、CP に対する腎ストレス反応は、正常な成人の腎臓に由来する十分に確立された不死化近位尿細管上皮細胞株である HK-2 細胞を使用して評価されました 29。 さらに、腸ストレス応答は、炎症性疾患および感染症のヒト腸上皮細胞モデルとして広く使用されている HCT-8 細胞株でシミュレートされています 30,31。 24時間の細胞生存率(補足図s2a、b)に基づいて、以下の細胞ベースの評価は、所定の各曝露時間でのIC50値に対応するCP用量で実行されました。 CP処理に応答して、HK-2およびHCT-8細胞はGdf15発現の増加を示しました(図1h、i)。 遺伝毒性ストレスに加えて、CP は RNA およびリボソームへの強い結合を介して、翻訳機構を含む細胞小器官の機能を破壊することがわかっています 32、33、34、35、36、37。 したがって、ISR におけるさまざまな種類の eIF2α キナーゼ関連シグナル伝達経路のうち、RNA 依存性 PERK および二本鎖 RNA 依存性 PKR 関連シグナルを調べて、Gdf15 発現レベルに対する考えられる影響を調べました。 特定の低分子ヘアピン RNA (shRNA) を使用して PERK または PKR をノックダウンし、Gdf15 発現に対するそれらの影響を調べました。 PERK 発現と比較して、PKR は両方の細胞型において CP 誘導性の Gdf15 発現に顕著に関与していました。 これらの発見により、PKR 関連シグナル伝達が腎損傷時の Gdf15 発現に決定的に関与していることが確認されました。
具体的には、CP誘発性AKIのマウスモデルにおいて、高レベルのGdf15発現が腎病理の予後に関連するかどうかを評価した。 カプラン・マイヤー生存プロットにより、Gdf15欠損マウスはCP治療後に野生型マウスよりも予後が不良であることが明らかになりました(図2a)。 これは、急性腎損傷および有害な結果に対する Gdf15 によって媒介される保護作用を示しています。 腎臓の肉眼的な解剖学的観察により、野生型マウスと比較した場合、CP治療に反応したGdf15ノックアウト(KO)マウスでは広範な組織損傷が明らかになりました(図2b)。 腎機能損傷を確認するために、クレアチニンおよび血中尿素窒素(BUN)レベルが測定されました。 CP処理後、Gdf15 KOでは野生型マウスよりもクレアチンおよびBUNレベルが有意に高かった(それぞれ図2c、d)。 さらに、過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色を使用して腎組織損傷の定量的評価を実行しました(図2e)。Gdf15 KOマウスでは、野生型マウスと比較して高度の尿細管拡張と尿細管空胞化が見られました。 CP に対する応答 (図 2f、g)。 さらに、CP誘導性の嚢胞形成は、野生型マウスと比較した場合、Gdf15 KOマウスで顕著でした(図2h)。 全体として、これらの結果は、CP 誘発性腎損傷に対する Gdf15 の保護的役割を示しました。
8週齢の野生型マウスとGdf15ノックアウト(KO)マウスをビヒクルまたはCP(20 mg / kg、腹腔内)で72時間処理しました(n = 3〜5)。 CPで処理された野生型およびGdf15 KOマウスのカプランマイヤー生存分析(n = 3〜5、p < 0.01)。 b 未処理マウスおよびCP処理マウスの腎臓切片の肉眼解剖学(過ヨウ素酸シッフ[PAS]染色)(倍率、5倍、スケールバー、1 mm)。 方法のセクションで説明したように、CP 治療の 72 時間後に比色アッセイ キットを使用して、クレアチニンの血清レベル (c) および血中尿素窒素 (BUN) (d) を測定しました。 結果は平均値と標準偏差を含む棒グラフとして表示され、各棒上の異なる文字はグループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 e PAS染色腎臓切片の組織学的検査(倍率、400×;スケールバー、50μm)。 尿細管拡張 (f)、尿細管空胞化 (g)、および嚢胞形成 (h) の定量分析。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 各バー上の異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 Gdf15、成長分化因子 15。
腎不全に加えて、粘膜炎も CP 誘発合併症に関連する既知の合併症です 14。 我々は、マウスのCP誘発性粘膜炎に対するGdf15欠損の影響を調べた。 肉眼的解剖学的観察に基づくと、Gdf15欠損は、長手方向の長さを考慮すると、CP誘発性のマウス小腸の短縮を有意に悪化させた(図3a)。 腸上皮層の顕微鏡検査の後、CP曝露マウスの絨毛または陰窩の鈍化または短縮が検出されましたが、これはGdf15 KOマウスで著しく重度でした(図3b、c)。 Gdf15 に関連した内膜長、絨毛、および陰窩の短縮は、栄養吸収に利用できる小腸管腔表面の減少を示唆しました。 さらに、病理学的重症度の組織病理学的スコアリングにより、Gdf15欠損がCP誘発性陰窩喪失を悪化させる可能性があることが明らかになりました(図3d–g)。 注目すべきことに、Gdf15欠損は炎症と潰瘍形成を増強し、これは空腸よりも回腸でより顕著でした(図3f、g)。
8週齢の野生型マウスとGdf15ノックアウト(KO)マウス(n = 3〜5)をビヒクルまたはシスプラチン(CP; 20 mg/kg)で72時間処理しました。 a 各グループの小腸の平均長。 b–c 空腸(b)と回腸(c)の絨毛(左)と陰窩(右)の平均長。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 バー上の異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 d – g 空腸(d)および回腸(e)のヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色切片の組織学的検査(倍率、100倍、スケールバー、100μm)。 空腸 (f) および回腸 (g) の病理学的重症度の定量化。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) はグループ間の有意差を示します (対応のない両側スチューデント t 検定を使用した場合、**p < 0.01、***p < 0.001)。 Gdf15、成長分化因子 15。
CP 誘発性の腸損傷に加えて、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) を使用して、明確に定義された潰瘍性大腸炎モデルを評価しました。 DSS治療に応答して、Gdf15 KOマウスは、野生型マウスと比較して、結腸内の炎症、潰瘍形成、陰窩喪失、および浮腫のレベルの増加を示しました(図4a、b)。 私たちは、高脂肪食(HFD)による治療を通じて慢性腎臓病の代表的なモデルを評価しました(補足図s3)。 このモデルでは、腸内に顕著な組織学的欠陥は見つかりませんでしたが、HFDへの慢性曝露(12週間)により尿細管拡張などの腎損傷が引き起こされました。 しかし、Gdf15 は HFD 誘発性腎病理学的事象には寄与しませんでした。 腸損傷が腎臓における有害な転帰と関連しているという仮定に基づいて、我々はさらに、大腸炎を誘発する損傷が腎臓の完全性に影響を与えるかどうかを調べた。 デキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発潰瘍性大腸炎を患う動物は、BUNレベルの上昇や尿細管拡張などの腎臓の病理学的転帰を示し、これは注目すべきGdf15 KO動物でした(図4c、d)。 尿細管障害に加えて、DSS誘発性大腸炎モデルでは、Gdf15欠損により形態的収縮や好中球浸潤などの糸球体損傷が増加することがわかりました(図4e)。 まとめると、Gdf15 欠損は、腎腸損傷モデルにおける組織学的変化および病理学的重症度に寄与しました。
8週齢の野生型マウスおよびGdf15ノックアウト(KO)マウス(n = 3〜5)をビヒクルまたは3% DSSで8日間処理しました。 ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色された結腸切片の組織学的検査 (a)。 結腸の病理学的重症度の定量化(b)(倍率、200×、スケールバー、100μm)。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) はグループ間の有意差を示します (**p < 0.01、***p < 0.001)。 c 過ヨウ素酸シッフ (PAS) で染色した腎臓切片の組織学的検査 (倍率、400 倍; スケール バー、50 μm)。 d DSS 処理の 48 時間後に、比色分析キットを使用して血中尿素窒素 (BUN) を測定しました。 結果は、Tukey ひげを含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) はグループ間の有意差を示します (**p < 0.01)。 e 尿細管拡張、糸球体縮小、糸球体硬化症の定量的分析。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) は 2 つのグループ間の有意差を示します (*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001)。 Gdf15、成長分化因子 15。
腸粘膜層は、微生物やその成分などの炎症誘発物質に対する極めて重要な障壁であることを考慮して、さらに評価されました。 粘膜防御を考慮すると、CP曝露は杯細胞の数を減少させ、回腸上皮層の粘液分泌を減少させましたが、これはGdf15 KOマウスでさらに悪化しました(図5a、b)。 小腸に加えて、Gdf15 欠損により結腸のムチン分泌が枯渇したことは、杯細胞またはそのムチン産生に対する Gdf15 の保護機能を示しています。 したがって、Gdf15 KOは、DSS誘発性大腸炎モデルにおいて粘膜層の重度の損失も誘発しました(図5c)。 グラム染色を行って管腔細菌の位置を特定し、内粘膜層の厚さを推定しました。 Gdf15欠損上皮細胞は、粘膜バリアが低下しているため、食事因子および微生物因子を含む管腔物質と密接に接触していました(図5d)。 その後、管腔細菌は内部組織に容易に移行し、血管系や腎臓を含む他の標的臓器で炎症性傷害を引き起こす上で重要な役割を果たす可能性があります。 現在の証拠は、Gdf15 を介した上皮および粘膜バリアの完全性が、腸由来の腎毒性因子または炎症促進因子の循環放出を妨げることを示唆しています。
a 8週齢の野生型マウスおよびGdf15ノックアウト(KO)マウス(n = 3〜5)をビヒクルまたはシスプラチン(CP; 20 mg/kg)で72時間処理しました。 アルシアンブルーによる回腸粘膜の染色(倍率、200×、スケールバー、100μm)およびその定量(倍率、200×、スケールバー、100μm)。 b〜d 8週齢の野生型マウスとGdf15 KOマウス(n = 3〜5)をビヒクルまたは3%DSSで8日間処理しました。 アルシアンブルーによる回腸粘膜の染色(倍率、200×、スケールバー、100μm)およびその定量(倍率、200×、スケールバー、100μm)(b)。 グラム染色(c)または16 rRNA in situ染色(d)を使用した腸粘膜細菌の代表的な画像(倍率、200×、スケールバー、100μm)。 粘膜層の厚さを測定しました(右のグラフ)。 定量分析は、Tukey ウィスカーと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして示されました。 棒付きの異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 Gdf15、成長分化因子 15。
粘膜微生物は粘膜マトリックスの合成または分解を調節する可能性があるため、宿主組織バリアの変化に加えて、腸管バリアの悪化に関連する潜在的な病因として管腔細菌組成を評価しました。 Illumina iSeq プラットフォーム (Illumina Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用して、3 つのライブラリから合計 1,821,852 のペアエンド リードが生成されました。 続いて、1,821,852 個のシングルエンド読み取りが QIIME2 (ver.2021.2) パイプラインを使用してさらに分析されました。 DADA2 アルゴリズムを使用して、3 つのライブラリーにわたる平均長 151 bp の 16 S rRNA 遺伝子の V4 領域の 2,012 個の代表的な配列が構築され、そのうち野生型では平均 100047.6、102951.5、100358.5、および 114681.25 個の特徴がカウントされました。それぞれ、(ビヒクル)、Gdf15 KO(ビヒクル)、野生型(CDDP)、およびGdf15 KO(CDDP)。 シャノン、シンプソン、およびチャオ 1 メトリクスに基づくアルファ多様性により、各微生物コミュニティ内の多様性の程度が類似していることが明らかになりました (補足図 s4a)。 対照的に、ベータ多様性はコミュニティ間で大きく異なりました(補足図s4b)。 さらに、門の組成分析により、ファーミクテス属とバクテロイドータがすべてのサンプルで最も優勢な門であることが実証されました(補足図s4c)。 組成はサンプル間で異なり、ファーミクテスがビヒクル群とCDDPグループで最も豊富な門としてそれぞれ総特徴の56.9%と59.6%に寄与したが、バクテロイドータの相対存在量はGdf15 KOマウスで増加した(補足図s4a)。 さらに、野生型マウスでは、プロテオバクテリアの比率はCDDP曝露に応答して元の値の9倍でしたが、Gdf15 KO動物ではCDDPによって誘発されるプロテオバクテリア存在量の上昇はわずかでした(補足図s4c)。 科または属レベルでの群集の詳細な評価により、未分類のラクノスピラ科がファーミクテス門に属する主要な科として各グループの25〜32%を占めていることが実証されました(図6a)。 しかし、Gdf15 KO 動物ではムリバキュラ科がバクテロイドタ門の主要な属でした。 さらなる評価を行って、Gdf15欠損に応じた細菌の相対存在量を種レベルでランク付けしました。 特に、Gdf15欠損により、Muribaculum intestinale、Duncaniella dubosii、Akkermansia muciniphila、Lachnospiraceae_UCG-006、Prevotellaceae、Bacteroidesvulgatus、およびDubosiellaの相対存在量が増加しました(図6bおよび補足図s4d)。これらはすべて、ムチングリカン採食者として同定されました。ヒトの腸内微生物叢38,39。 さらに、PICRUSt2(ver.2.3.0)を使用したプロファイルに基づくメタゲノム予測により、Gdf15欠損に応答してムチン分解関連酵素をコードする遺伝子の有意な増加が実証されました(図6c)。 特に、Gdf15欠損は、シアル酸O-アセチルエステラーゼ(EC:3.1.1.53)、アリールスルファターゼN-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ(EC:3.1.6.1)、エキソα-シアリダーゼ(EC:3.1.1.53)の遺伝子の発現レベルを有意に高めた。 6.12)、β-マンノシダーゼ (EC:3.2.1.18)、α-L-フコシダーゼ (EC:3.2.1.25)、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ (EC:3.2.1.51)、およびエンド-α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ (EC) :3.2.1.52)。 まとめると、Gdf15 欠損は、粘膜バリアの破壊とともにムチン代謝に関連する細菌および酵素の量を同時に増加させ、Gdf15 が微生物によって誘発されるムチン分解に対抗することを示しています。
系統学的組成を決定するために、糞便細菌を 16 S rRNA 分析に供しました。 a、b 各上位 30 の豊富な分類群の細菌が、対応する存在量 (a) および相対存在量 (b) とともにリストされます。 再注目された微生物は、強力なムチン採食の属または種です。 c PICRUSt2を使用して16 S rRNAプロファイルから再構築されたムチン分解酵素に関連する遺伝子。 データは、すべてのデータポイント (丸) の平均値 ± 標準偏差 (SD) (N = 3) を表します (結果は平均値 ± SD として表示されます。アスタリスク (*) はグループ間の有意差を示します (*p < 0.05、**p) < 0.01、***p < 0.001)、Gdf15、成長分化係数 15。
腎腸損傷に対する Gdf15 媒介の対抗作用を考慮すると、オートファジーが代表的な防御機構の 1 つとして評価されました。 まず、代表的なオートファゴソームマーカーである mCherry および GFP タグ付き微小管関連タンパク質 1 A/1B 軽鎖 3 B (LC3B) の発現用プラスミドを使用して、腸細胞および腎臓細胞におけるオートファジー流動への Gdf15 の関与を評価しました。 (図7a、b)。 オートファゴソームが後期エンドソームまたはリソソームに融合すると、酸性オートリソソームが生成され、酸感受性 GFP のシグナルが失われます。 さらに、酸非感受性 mCherry のシグナルは、二重タグ付きタンパク質が分解されると最終的に失われます。 CPで損傷された細胞はオートファゴソーム形成(黄色の点)を示し、続いて化学ストレス下でユビキチン化タンパク質をクリアランスするためにオートリソソーム形成(赤色)を示しました。 しかし、Gdf15 欠損細胞は、正常なオートファジーの流れに欠陥を示しました。 Gdf15ノックダウンではオートリソソーム形成が著しく干渉され、その結果、赤色蛍光点のレベルが低下した黄色点シグナルが延長され(図7a、b)、オートファジー流動の促進におけるGdf15の重要な役割を示唆しています。
コントロールまたは Gdf15 欠損細胞 (HCT-8 (a) または HK-2 (b) 細胞) を pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT でトランスフェクトしました。 トランスフェクションの 24 時間後、細胞をビヒクルまたは 10 μmol/L シスプラチン (CP) で 48 時間処理しました。 細胞を共焦点顕微鏡下で観察して、pH応答性のオートファジーの流れをモニターした(倍率、400×、スケールバー、10μm)。 定量分析は、Tukey ひげ (下のグラフ) とすべてのデータポイント (丸) を含むプロットとして示されました。 棒付きの異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 Gdf15、成長分化因子 15。
次に、Gdf15 と粘膜保護の間のメカニズムの関連を調査しました。 したがって、オートファジーは、化学物質誘発性粘膜炎に対する防御シグナル伝達機構の 1 つとして評価されました。 我々は、Gdf15ノックダウン腸細胞がLC3Bの活性化の低下を示したことに注目し(図8a)、それによってGdf15がオートファジーを正に制御していることを示した。 さらに、我々は、オートファジーによって分解される運命にあるカーゴの受容体であるp62がユビキチンおよびLC3に結合し、オートリソソーム内のユビキチン化タンパク質のクリアランスを促進することを観察した。 p62 は CP に曝露された腸細胞で最終的に分解されましたが、Gdf15 欠損細胞は CP 誘導性の分解プロセスに対して耐性を示しました。 粘膜媒介性腸保護を考慮すると、ヒト腸上皮細胞を用いたインビトロ評価により、ムチン2および4のGdf15依存性発現が実証された(図8b)。 さらに、オートファジーシグナル伝達を阻害すると、CP誘発性苦痛に応答したムチン2/4誘導が弱まり、Gdf15媒介オートファジーシグナル伝達が腸ムチン発現に関与していることが示された。
a コントロールベクターまたは shGdf15 ベクターをトランスフェクトした HCT8 細胞をビヒクルまたは 10 μmol/L シスプラチン (CP) で 48 時間処理しました。 細胞溶解物をウェスタンブロット分析に供しました。 b コントロール(ネガティブコントロールshRNA)またはshGdf15プラスミドをトランスフェクトしたHCT-8細胞を、20μmol/L 3-メチルアデニン(3-MA)の非存在下または存在下でビヒクルまたは10μmol/L CPで48時間処理し、ムチン 4 またはムチン 2 の mRNA レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) 分析を使用して測定されました。 データ値は、平均±標準偏差 (SD) およびすべてのデータポイント (丸) として表示されます。 アスタリスク (*) は CP 治療群との有意差を示します (***p < 0.001)。 四角で囲まれたブロットは、shRNA を使用した Gdf15 の効率的な抑制を示します。 c ヒト細胞における Gdf15 レベルに応答したオートファジー制御ネットワーク (ARN; https://autophagyregulation.org) のクラスター評価。 境界線の太さは、各ノードの媒介中心性のレベルを示します。 d コントロール(ネガティブコントロールshRNA)またはshGdf15プラスミドをトランスフェクトしたHCT-8細胞をビヒクルまたは20μmol/L CPで12時間処理し、RT-qPCR分析を使用してmRNAレベルを測定しました。 データ値は、平均±SDおよびすべてのデータポイント(丸)として表示されます。 バー上の異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 Gdf15、成長分化因子 15。
Gdf15 誘導オートファジーに関与するシグナル伝達ネットワークの詳細に対処するために、オートファジー制御ネットワーク (ARN) データベースを使用して、ヒト細胞における Gdf15 発現の体系的なバイオインフォマティクス分析を実行しました。このデータベースには、さまざまな証拠に基づくオートファジー機構に関連するコンポーネント、その制御因子、転写因子、miRNA 調節因子、およびシグナル伝達ネットワーク コネクターを多層図で示した 40。 腸細胞におけるヒトGdf15応答性遺伝子プロファイルに基づいて、受容体関連オートファジーシグナル伝達の2つのクラスターを同定しました(図8c)。 われわれは、Gdf15がシグナル伝達階層系におけるガンマアミノ酪酸受容体関連タンパク質様1(GABARAPL1)を増強し、タンパク質間相互作用を通じてシグナル伝達を媒介し、核内受容体ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ(PPAR-γ)を下方制御することを発見した。 -調節された転写ネットワーク。 GABARAPL1 と PPAR-γ は、Gdf15 レベルに応答する ARN の高い媒介中心性を持つ重要なコンポーネントです。 さらに、Sp1 や初期成長応答遺伝子 1 (Egr1) など、GABARAPL1 によって調節される高度な転写因子は、Gdf15 応答性ネットワーク変化に寄与しました。 さらに、CPに曝露されたヒト腸細胞におけるオートファジーネットワークのGdf15によって調節される重要なモジュールを調べました。 腸上皮をCPに曝露すると、GABARAPL1発現がわずかに増強され、Gdf15によって正に制御されました(図8d)。 対照的に、化学ストレスは PPARγ の発現を下方制御しました。
次に、オートファジーと腎組織損傷との関連性を予測することを目的としました。 腎臓病におけるオートファジーの正確な役割については依然として議論の余地があるが、AKI患者は代表的なオートファジーバイオマーカーであるベクリン-1(BEC1)レベルの低下を示す傾向がある(図9a)。 臨床トランスクリプトーム分析により、Gdf15発現が高い被験者は、急性または慢性腎損傷中にBEC1レベルの増加を示す傾向があることも明らかになりました(図9b)。 実験的に、Gdf15 KOマウスは、代表的なオートファゴソームマーカーであるLC3B IIの発現低下を示し(図9c)、それによってGdf15がオートファジーを正に制御していることが示された。 腎組織発現レベルと一致して、HK2細胞におけるGdf15ノックダウンはLC3Bの活性化レベルを減弱させた(図9d)。 さらに、Gdf15欠損細胞は、オートファジーによって分解される運命にあるカーゴの受容体であるp62のレベルの上昇を示し、Gdf15が腎尿細管細胞におけるオートファゴソーム形成だけでなくオートリソソームプロセスにも寄与していることを示した。 対照的に、Gdf15 抑制により CP 誘導性腎細胞死 (PARP1/2 切断) が増加したことは、CP 曝露に応答したオートファジーシグナル伝達を介した Gdf15 の保護効果を示しています。 さらに、オートファジーシグナル伝達の阻害は、CP誘導性腎細胞死を悪化させました(図9e)。 まとめると、Gdf15 とその下流のオートファジー経路は、機構的に腎細胞死に対する保護を提供します。
a 急性腎障害患者における BECN1 の発現 (GSE30718)。 b 急性腎障害 (GSE30718、左) または慢性腎臓病 (GSE66494、右) の患者における Gdf15 レベルに基づいて、最高レベルの 20 サンプルと最低レベルの 20 サンプルを選択し、続いて BECN1 発現レベルを比較しました。 結果は、Tukey ひげを含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) は、低発現グループとの有意差を示します (* 対応のない両側スチューデント t 検定を使用した場合、p < 0.05)。 c 8週齢の野生型マウスおよびGdf15ノックアウト(KO)マウス(n = 3〜5)をビヒクルまたはシスプラチン(CP; 20 mg / kg)で72時間処理しました。 腎臓組織溶解物をウェスタンブロッティングに供しました。 結果は、Tukey ひげを含むプロットとして表示されます。 グラフは、ウェスタンブロットからの軽鎖 3 B (LC3B) の相対密度を示しています。 バー上の異なる文字は、グループ間の有意差を表します (p < 0.05、n = 3)。 d コントロールまたはshGdf15ベクターでトランスフェクトしたHK-2細胞をビヒクルまたは10μmol/L CPで48時間処理しました。 細胞溶解物をウェスタンブロット分析に供しました。 e HK-2細胞を、20μmol/L 3-メチルアデニン(3-MA)の非存在下または存在下で、ビヒクルまたは10μmol/L CPで48時間処理しました。 細胞溶解物をウェスタンブロット分析に供しました。 Gdf15、成長分化因子 15。
最後に、臨床トランスクリプトーム分析により、急性腎不全患者におけるオートファジーシグナル伝達が検証されました。 腎損傷中の統合されたストレス応答を考慮すると、PKR eIF2αキナーゼ媒介ストレスシグナル伝達は、腎損傷およびCP曝露中のGdf15誘導に決定的に関与していました(図1)。 したがって、我々は、AKI患者におけるGABARAPL1発現とPKRレベルを評価した。 PKRレベルが上昇した被験者はGABARAPL1発現の増加を示し、ISRがGABARAPL1発現を増強することを示した(図10a)。 さらに、PKR応答性GABARAPL1は、損傷した腎組織におけるオートファジーバイオマーカーであるBECN1のレベルの改善と正の相関があった(図10b)。 さらに、Gdf15レベルが高い患者は、GABARAPL1レベルの増加とPPARγ発現の減少を示す傾向があり、急性腎不全時のGdf15によって変化したオートファジーネットワークを示唆している(図10c)。 さらに、2つの重要なオートファジーネットワーク分子、GABARAPL1およびPPAR-γの調節パターンの臨床データベースに関連付けられた予測は、CPに曝露された腎尿細管細胞で観察されたものと類似していた(図10d)。 まとめると、ストレス応答性Gdf15はオートファジーシグナル伝達ネットワークを調節し、損傷した腸-腎臓軸における粘膜の完全性と腎細胞の生存の維持に寄与しました(図10e)。
a 急性腎障害患者のプロテインキナーゼ R (PKR) レベル (GSE30718) に基づいて、最高 20 サンプルと最低 20 サンプルを選択し、続いてガンマアミノ酪酸受容体関連タンパク質様 1 (GABARAPL1) を比較しました。 b 急性腎障害患者(GSE30718)の GABARAPL1 レベルに基づいて、最高 20 サンプルと最低 20 サンプルを選択し、続いて BECN1 発現を比較しました。 c Gdf15 レベルに基づいて、最高 20 サンプルと最低 20 サンプルを選択し、続いて急性腎障害患者 (GSE30718) における GABARAPL1 (左) と PPAR-γ (右) の発現を比較しました。 結果は、テューキーのひげと外れ値 (オレンジ色の円) を含むプロットとして表示されます。 アスタリスク (*) は、低発現グループとの有意差を示します (対応のない両側スチューデント t 検定を使用した場合、*p < 0.05、**p < 0.01)。 d コントロール(ネガティブコントロールshRNA)またはshGdf15プラスミドをトランスフェクトしたHK-2細胞をビヒクルまたは20μmol/Lシスプラチン(CP)で12時間処理し、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析を使用してmRNAレベルを測定しました。 データ値は平均±標準偏差 (SD) として表示され、バー上の異なる文字はグループ間の有意差を表します (p < 0.05)。 e Gdf15 に関連した保護の機構スキーム。 細胞は、尿細管または粘膜の損傷後に統合されたストレス応答を活性化し、Gdf15 の産生を引き起こします。 ストレス応答性 Gdf15 は、腸ムチン産生や細胞傷害に対する腎細胞の生存などの内因性適応のためのオートファジー制御ネットワークの再組織化において重要な役割を果たします。 さらに、保護に関連した Gdf15 は、傷ついた腸内の粘液を分解する微生物叢に対抗しました。 Gdf15、成長分化因子 15; PPAR-γ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ。
本研究では、Gdf15 が病的ストレスに対する内因性適応分子として評価されました。 特に、ISR活性化Gdf15は、組織損傷に応答したオートファジーネットワークのシグナル伝達再プログラミングを介して細胞保護を促進しました。 腎細胞の保護に加えて、Gdf15 に関連したオートファジーシグナル伝達は、腎損傷時の粘液分解微生物叢に対するムチン産生の制御を介した腸管バリアの維持にも関与していました。 Gdf15 を介した防御に関する臨床データセットおよび実験に基づく予測と証拠は、腸および腎臓の損傷に対する分子予防または介入のための強力な標的についての洞察を提供します。 Gdf15 は、疾患進行中の炎症、細胞生存、増殖、アポトーシスを制御する、さまざまな組織損傷の初期バイオマーカーとしても評価されています 41。 さらに、Gdf15 の血清レベルの上昇は CKD 進行リスクの増加と関連しており、特に高齢者および若年層における腎障害のマーカーとしての有用性が示されています 25,42。 さらに、尿中 Gdf15 レベルは、CKD43 患者における有害転帰、腎臓の組織パターン、および腎代替療法の必要性と関連している可能性があります。 腎臓移植は血清 Gdf15 レベルを低下させると報告されていますが、腎切除術ではこれらのレベルが上昇することが判明し、腎臓の Gdf15 がさまざまな生理学的機能を調節していることが示されています 44。 ここで、ISR関連Gdf15は急性腎腸障害の貴重な予後バイオマーカーである可能性があるが、他のさまざまな腎損傷における予測を一般化するには追加の評価が必要である
Gdf15 は、細胞ストレスに応答して ARN の再構成を促進します。 しかし、Gdf15 を介したオートファジーの制御に関する機構的な証拠は依然として限られています。 オートファジーにおける Gdf15 の作用の間接的な証拠の観点からは、Gdf15 と酸化低密度リポタンパク質を組み合わせると、アテローム性動脈硬化性プラーク形成中のヒトマクロファージにおけるオートファジー関連タンパク質の発現を調節することにより、オートファジーのプロセスが損なわれることが示されました 45。 オートファジー機構において、GABARAPL1 は、Gdf15 誘導後の PKR 関連腎病因における保護シグナル伝達メディエーターであると予測されました。 哺乳動物細胞では、カーゴ膜は、オートファジー流動において重要な役割を果たす、GABARAP または LC3 タンパク質を含むオートファジー関連タンパク質 8 ファミリーによって認識され、結合されます 46,47。 LC3 はファゴフォア膜の伸長に関与していますが、GABARAPL1 を含む GABARAP はファゴフォアの伸長と封鎖に不可欠であり、オートファゴソームの成熟をもたらします 48。 さらに、GABARAP サブファミリーは、栄養や代謝ストレスシグナル伝達などの内部または外部のストレス因子に応答してオートファジー機構を開始する重要なストレス応答性キナーゼである ULK1 (Unc 様オートファジー活性化キナーゼ 1) を正に制御します 49。 本研究では、急性腎損傷患者におけるストレス応答性 PKR および Gdf15 発現は GABARAPL1 発現と正の相関があり、これにより腎尿細管および腸上皮損傷に対する防御細胞プロセスとしての初期のオートファジー形成と成熟が促進される可能性があります。 腎損傷におけるオートファジーの役割は包括的に解明される必要があるが、初期のストレス応答性オートファジーは、腎損傷時の細胞死を抑制し、その後腎尿細管細胞の生存を改善する適応応答と関連している可能性がある50。 さまざまなシグナル伝達経路がオートファジー関連分子経路に影響を与えることが知られています。 CP 誘発性の病理学的転帰は、急性腎損傷時の 5'-アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ アルファやサーチュイン 3 などの代謝再プログラミングに関連した生化学的シグナル伝達メディエーターを介した保護的オートファジー活性化と負の相関が見られています 51,52。 さらに、オートファジー機構は腎細胞内の損傷したリソソームを隔離し、オートファゴソーム形成を介して取り込まれ、AKI53 の期間中にリソソームの恒常性と健康な細胞の完全性をもたらします。 さらに、オートファジーに関連した細胞内分解プロセスは、折り畳まれていないタンパク質のストレス応答に対処するムチン分泌腸細胞において重要な役割を果たしています 54,55。 オートファジー経路に欠陥がある場合のムチン生合成レベルが過剰になると、腸の恒常性が破壊される可能性があります。 保護的オートファジーとは対照的に、オートファジーシグナル伝達は、エンドトキシン関連腎損傷モデルにおける炎症誘発性反応を介した有害な影響と関連している56。 注目すべきことに、オートファジーは軽度の腎虚血再灌流傷害に対して保護を与えることができる。 ただし、この効果は重傷の場合には観察されません57。 さらに、腎臓近位尿細管におけるオートファジーの持続的な活性化は、マウスモデルにおける腎間質線維症を刺激することが示されました 58。 したがって、オートファジー中の腎細胞と腸細胞の正確な寄与は、疾患の重症度や進行に応じて徹底的に評価する必要があります。
本研究では、CP治療を用いた急性腎障害モデルにおいて、オートファジーシグナル伝達がPKR媒介ISRと関連していた。 CP は DNA 付加物を形成することで遺伝毒性を誘発し、これにより遺伝子複製や細胞ストレス応答が妨げられます。 しかし、CP によって引き起こされる病理学的結果は、RNA 合成の阻害や RNA への直接結合を含む複数の機構に関連している可能性があります 35、36、37。 CP-DNA付加物は、リボソームRNA(rRNA)遺伝子プロモーターへの結合を妨害する可能性があるヒト上流結合因子などの高移動度グループドメインタンパク質に対して高い結合活性を示すことが判明した35,37。 さらに、CP はリボソームと mRNA に直接挿入し、リボソームの停止を引き起こし、全体的な翻訳を抑制します 36。 ストレスによるリボソームの失速は、ISR27、59、60、61 の主要な生化学経路である PKR を介して、eIF2α を介した全体的な翻訳阻害を引き起こします。 PKR に関連する ISR は、ウイルス感染、特異的翻訳阻害、酸化および ER ストレス、成長因子欠乏、細菌感染などのさまざまな内部および外部ストレス因子によって活性化される可能性があります 27,62。 特に、リボソームストレスに関連した PKR 活性化は、不均衡なサイトカインおよび成長因子プロファイルを介して炎症性および慢性疾患に関与する強力なメカニズムです 63,64,65。 さらに、AKIおよびCKDの患者はプラチナ曝露に関係なくそのような関連性を示したため、PKR関連事象は、化学物質特有の腎毒性ではなく、全身性の腎病理学的ストレスと関連している可能性がある(図1)。 したがって、ストレス応答性シグナル伝達がさまざまな腎損傷において有害な結果を促進するか、または生物学的恒常性を回復するかどうかを確立するには、広範な分子証拠が必要です。
結論として、ストレス応答性 Gdf15 は急性腎腸損傷に対する適応分子であることが証明されました。 Gdf15 の発現は、PKR に関連した ISR によって媒介されるシグナル伝達の活性化に依存しており、これは腎損傷患者における臨床トランスクリプトーム分析によって検証されました。 特に、ストレス応答性 Gdf15 は腸粘膜および腎細胞の完全性の維持に関与していました。 機構的には、Gdf15 は、細胞保護オートファジーシグナル伝達の再組織化を介してムチン産生と細胞保護を促進することにより、急性腎腸障害を制御しました。 さらに、Gdf15 は粘液分解細菌群集の制御と関連していました。 まとめると、ストレス応答性の内因性適応反応は、ISR-Gdf15-オートファジーネットワークシグナル伝達軸の病理学的プロセスに対抗する可能性があり、それによって予測バイオマーカーの開発と腎腸障害に対する介入のための新しい戦略を切り開く可能性がある。
腎臓の遺伝子発現は、AKI (gse30718、n = 47) または CKD (gse66494、n = 61) の患者で評価されました。 AKI を患うヒト腎臓は生検されることがほとんどないため、遺伝子発現解析は限られています 66。 AKI患者からの腎生検サンプルの供給が限られているため、腎外植片を有する患者をヒトAKI66のモデルとして追跡調査した。 腎臓移植を受けたすべての被験者が AKI を経験するため、拒絶反応のない早期腎臓移植はヒト AKI の優れたモデルとなります。 AKI (gse30718) を伴う移植からの生検を、安定した移植の元のプロトコルの生検からの生検と比較しました。
CKD 患者は不可逆的かつ進行性のネフロン喪失を示し、その後、糸球体線維症、尿細管萎縮、尿細管間質線維症が続きます。これらは、最初の病因に関係なく、ヒトの進行性腎疾患の一般的に観察される特徴です 67。 組織病理学的に確認された CKD (gse66494) 患者 48 人からの生検標本を分析し、2 つの独立した発見および検証プロセスを使用して尿細管間質線維症と尿細管細胞損傷の原因遺伝子を同定しました 67。 患者は、IgA腎症(n = 15)、膜性腎症(n = 7)、ループス腎炎(n = 6)、微小変化型ネフローゼ症候群(n = 3)、膜性増殖性糸球体腎炎(n = 3)など、さまざまな組織型の腎疾患を示していました。 )、アミロイドーシス(n = 3)、抗好中球細胞質抗体関連糸球体腎症(n = 2)、糖尿病性腎症(n = 2)、およびその他の腎症(n = 6)。
本研究では、ヒト腸上皮細胞株 HCT-8 とヒト腎臓細胞 (HK-2 および HEK293) を使用しました。 マイコプラズマフリー細胞株は American Type Culture Collection から購入し、10% (v/v) 熱不活化ウシ胎児血清 (Welgene)、50 U/mL ペニシリン、および50 μg/mL ストレプトマイシン (Welgene)、37 °C、加湿 5% CO2 インキュベーター内。 細胞を60 mmディッシュに5×105細胞の密度で播種し、細胞がコンフルエントに達したときに培地を補充した。 培地を12時間補充した後、生理食塩水中のCP(10μmol/L)を細胞培養物に24または48時間添加した。 続いて、タンパク質と RNA を抽出するために細胞を収集しました。 CP 粉末は Sigma-Aldrich (#PHR1624) から購入し、ストック溶液は生理食塩水で調製しました。 細胞計数および生存率は、血球計数器を備えたトリパンブルー色素(Merck)を用いた色素排除試験を使用してアッセイした。
この手順は、以前に公開された方法68に基づいています。 詳細には、C57BL/6 マウス (6 週齢雄、平均体重 16 ~ 18 g) を Jackson Laboratories (米国メイン州バーハーバー) から購入し、Gdf15 KO C57BL/6 マウスを Se 博士のご厚意により提供していただきました。 -ジン・リー氏(ジョンズ・ホプキンス大学、メリーランド州ボルチモア、米国)。 同じ年齢のすべてのマウスを 1 つのケージに入れ、偏りなくランダムに別のケージに移しました。 マウスは特定の治療グループにランダムに割り当てられました。 マウスを実験前に 14 日間順応させ、22 ± 2 °C、相対湿度 45 ~ 55%、12/12 時間の明暗サイクルで維持しました。 ケージあたり 3 匹のマウスを飼育し、透明なポリプロピレンの本体とステンレス鋼の上部カバーで構成された環境的に保護されたケージ内で十分な餌と水を与えました。 化学療法誘発性 AKI は、シスプラチン (20 mg/kg) の腹腔内注射によって誘発されました。 8週齢の野生型マウスとGdf15 KOマウスをビヒクルまたはCP(20 mg/kg、腹腔内)で72時間処理しました(n = 4〜5)。 DSS誘発性大腸炎および腎合併症を誘発するために、生後7週齢の雄マウスに3% DSS(分子量36,000~50,000 Da; MP Biomedical、米国オハイオ州ソロン)を飲料水に加えて8日間自由摂取させた。 2日後、マウスをエーテル深麻酔下で屠殺した。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 簡単に説明すると、腎臓切片を PAS で染色し、倒立顕微鏡 (Nikon-Eclipse Ts2R、東京、日本) を使用して調製した切片の顕微鏡写真を取得しました。 得られた画像は、Adobe Photoshop CS6 および Multi Gauge V3.0 を使用して定量化されました。 採取した腎臓の一部を 4% PFA で 4 °C で固定し、パラフィンワックスに包埋し、PAS で染色しました。 残りの部分は RNA とタンパク質の単離のために 2 つの部分に分割され、液体窒素中で -120 °C で 10 ~ 15 分間急速冷凍され、臓器採取日に均質化されました。 腎尿細管損傷の程度は、損傷した腎尿細管の割合として表されました70。 統計解析のために、各標本の視野をランダムに選択し、顕微鏡下で尿細管の直径と内腔の直径を撮影し、ImageJ ソフトウェアを使用して病変を統計的に解析しました。 尿細管の直径は、尿細管の最も狭い部分を横切って基底膜から反対側の基底膜まで測定した。 管腔の直径は、尿細管の最も狭い部分を横切る頂端膜間の距離を測定することによって決定されました。 尿細管の空胞化のレベルは、近位尿細管に影響を及ぼし、基底膜にまで広がる空胞のレベルを段階的に評価することによって評価されました71。 嚢胞性指数は、腎臓の総面積に対する嚢胞性面積の割合として計算されました 72。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 腸分析のために、小腸を直ちに取り出し、カルノア溶液で固定し、パラフィンに包埋した。 キシレンを使用して切片を脱蝋し、一連の段階的アルコール溶液を使用して再水和し、確立された実験室プロトコルを使用してヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色して、組織病理学的病変を明らかにしました。 空腸および回腸の絨毛および陰窩の長さは、マイクロメーターを使用して測定されました。 各切片から少なくとも 9 個の絨毛が測定され、各グループの平均がとられました。 形態学的評価は、十分に確立された基準を使用して盲検法で実施されました。 簡単に言うと、小腸組織の H&E 染色断面を 0 ~ 4 のスケールでスコア化し、次の基準に基づいて組織病理学的重症度を決定しました。0、正常組織からの変化なし。 グレード 1、粘膜に存在する軽度の炎症。主に単核細胞で構成され、上皮損傷はほとんどありません。 グレード 2、グレード 1 スコアを超える多巣性炎症。単核細胞と少数の多形核細胞 (好中球)、基底膜から引き離された陰窩腺、杯細胞からのムチン枯渇、および時折上皮が粘膜から内腔へ引き離されます。 グレード 3、粘膜下層に進行する単核細胞と好中球、ムチン枯渇の増加を伴う陰窩膿瘍、および上皮破壊の存在を含む、グレード 2 スコアを超える多巣性炎症。 グレード 4、陰窩は存在せず、主に好中球からなる重度の粘膜炎症があり、上皮はもはや存在しないか、完全に剥離しています。 各マウスについて、小腸サンプルごとに 3 つの視野の平均を検査しました。 すべての評価者は現在の実験情報を知らされていませんでした。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 調製した組織切片をキシレン中で 10 分間脱パラフィンし、エタノール (100、90、80、70、および 50%) でそれぞれ 3 分間再水和し、その後蒸留水中に 10 分間静置しました。 AB 8GX (1% [w/v] アルシアンブルー 8GX、Biosesang、ソウル、韓国) 溶液を 25 °C で 30 分間切片に適用し、続いて水道の流水で 2 分間洗浄しました。 0.1% (w/v) 核ファストレッドを用いて対比染色を 5 分間行い、続いて水道の流水で 2 分間洗浄しました。 続いて、染色切片を95%エタノールで2回交換し、無水アルコールで2回交換して脱水した。 乾燥した切片をキシレンで数分間洗浄し、合成封入剤 (Thermo Fisher Scientific、ソウル、韓国) を使用して封入しました。
グラム染色は次のように実施しました 45: 組織切片をキシレンで脱パラフィンし、エタノールで再水和し、dH2O で 5 分間インキュベートし、クリスタルバイオレットを使用して 1 分間染色し、水道水で洗浄しました。 次に、スライドをグラムヨウ素で 1 分間染色し、水道水ですすぎ、95% エチルアルコールに 5 ~ 10 秒間浸漬し、再び水道水ですすいだ。 スライドをサフラニンで 1 ~ 2 分間再度染色し、水道水ですすいだ。 染色切片を 95% エタノールで 2 回交換し、続いて無水アルコールで 2 回交換して急速に脱水し、キシレンで透明にし、合成封入剤 (Thermo Fisher Scientific、韓国) に封入しました。 サフラニンは脱色したグラム陰性細胞を赤/ピンクに染色しますが、グラム陽性菌は青色のままです。
16 S rRNA のプローブを使用した in situ 検出は次のように実行されました。組織をキシレンで脱パラフィンし、エタノールから水への勾配を介して再水和しました。 切片を 16 S rRNA 遺伝子 (5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3') に対するユニバーサル Cy3 標識細菌プローブとともに 50 °C で一晩インキュベートし、核染色のために DAPI で対比染色しました。
この手順は、以前に公開された方法68に基づいています。 クレアチニンレベルは、クレアチニン血清検出キット(KB02-H2、Arbor Assays、ミシガン州、米国)を製造者の指示に従って使用して測定しました。 簡単に説明すると、マウスを 30 μL のイソフルラン (hana Pharm Co.、韓国、ソウル) で麻酔し、眼窩洞穿刺を行って血液を 10 μL の 0.5 M EDTA を含む 1.5 mL チューブに採取し、その後遠心分離しました。 1000×gで15分間かけて血漿を分離し、その後-80℃で保存した。 アッセイを実行する前に、すべてのサンプルを 18,341 × g で 15 分間遠心分離しました。 次に、25 μL のアッセイ希釈液で希釈した既知濃度のクレアチニンストック、血液サンプル、または水(ブランク)を含む標準溶液(25 μL)を、96 ウェルマイクロプレート内で 100 μL の DetectX クレアチニン試薬と混合し、30 分間インキュベートしました。 。 光学密度は、マイクロプレートリーダーを使用して490nmの波長で測定した。 BUNは、尿素窒素比色検出キット(KB024-H1、Arbor Assays)を製造業者の指示に従って使用して測定した。 簡単に言うと、得られた血漿を18,341×gで10分間遠心分離し、蒸留水(1:20)で希釈した。 次に、50 μL のサンプルまたは適切な標準を 96 ウェル プレートに 2 つずつピペットで移しました。 次に、リピーターピペットを使用して、75 μL の発色試薬 A および B を各ウェルに添加しました。 プレートを 25 °C で 30 分間インキュベートし、光学密度を 450 nm で測定しました。
簡単に説明すると、ステンレス鋼ビーズ (5 mm) を含む 1 mL の改変溶解バッファー (1% [w/v] ドデシル硫酸ナトリウム [SDS]、1.0 mM オルトバナジン酸ナトリウム、および 10 mM トリス; pH 7.4) で腎臓サンプルを溶解しました。そして、TissueLyser II(Qiagen)を使用して3分間ホモジナイズした。 溶解物を13,475×g、4℃で10分間の遠心分離によって清澄化し、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce、米国イリノイ州ロックフォード)を使用して定量した。 Bio-Rad ゲル ミニ電気泳動システム (Bio -ラッド、ヘラクレス、カリフォルニア州、米国)。 タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜 (0.45 μm; EMD Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州ビレリカ) に転写し、次にトリス緩衝生理食塩水と 0.1% Tween (TBST) 中の 5% スキムミルクで 1 時間ブロックしました。 続いて、メンブレンを目的の一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 TBSTで3回洗浄した後、ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体とともに2時間インキュベートし、続いてTBSTで30分間3回洗浄しました。 抗体結合は、増強された化学発光基質(ELPIS Biotech、大田、韓国)を使用して検出されました。 以下の抗体をウェスタンブロッティングに使用しました: マウスモノクローナル抗β-アクチン (1:1000; SC4778、Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz、CA)、ウサギポリクローナル抗 PARP1/2 (1:1000; SC7150、Santa Cruz Biotechnology) )、およびウサギポリクローナル抗Gdf15(Abclonal、Woburn、MA、USA)。 使用した二次抗体は、HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG、ポリクローナル抗体 (ADI-SAB-300-J、Enzo Biochem Inc.、米国ニューヨーク州ファーミングデール)、およびヤギ抗マウス IgG (BML-SA204、Enzo Biochem Inc) でした。 .米国ニューヨーク州ファーミングデール)。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 凍結組織を、TissueLyser II (Qiagen) を使用して、ステンレス鋼ビーズ (5 mm) を含む 1 mL RiboEx 溶液 (GeneAll Biotechnology、ソウル、韓国) 中で 3 ~ 6 分間ホモジナイズしました。 メーカーの指示に従って、RiboEx (GeneAll Biotech、ソウル、韓国) を使用して全 RNA を抽出しました。 続いて、TOPscript RT DryMIX cDNA 合成キット (Enzynomics, Daejeon, Korea) を使用して、各サンプルからの RNA (500 ng) を cDNA に転写しました。 MyCycle Thermal Cycle (Bio-Rad) で N-Taq DNA ポリメラーゼ (Enzynomics) を使用し、次のパラメーターを使用して cDNA を増幅しました: 95 °C で 5 分間の変性、続いて 95 °C で 10 秒間の変性を 25 サイクル、アニーリングは 60 °C で 15 秒、伸長は 72 °C で 30 秒です。 以下のプライマーを PCR に使用しました: ヒト GAPDH、5'-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TT-3' および 5'-CTG TGG TCA TGA GTC CTT CC-3'。 ヒト MUCIN2、5'-TTA CCC ACT GCG TGG AAG AC-3' および 5'-GCA TTC CCG TGA ACA CAC AC-3'。 ヒト MUCIN4、5'-GAC GAC TTC AGG ATG CCC AA-3' および 5'-AGG GCC AGG GTG TCA TAG AT-3'。 ヒト Gdf15、5'-ACG CTA CGA GGA CCT GCT AA-3' および 5'-AGA TTC TGC TGC CAG CAG TTG GT-3'。 ヒト GABARAPL1、5'-AGG AGG ACC ATC CCT TTG AGT A-3' および 5'- TCC TCA GGT CTC AGG TGG ATT-3'。 ヒト PPARγ、5'-TTC AGA AAT GCC TTG CAG TG-3' および 5'-CAC CTC TTT GCT CTG CTC CT-3'。 各ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 生成物のアリコートを 1.2% (w/v) アガロースゲル電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色することによって視覚化しました。 リアルタイム PCR の場合、SYBR green (SG、TOPreal™ qPCR 2X PreMIX、Enzynomics) を使用して cDNA を増幅し、次のパラメーターを使用して Rotor-Gene Q (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) で実行しました: 94 °C で 2 分間の変性、その後、98 °C で 10 秒間の変性、59 °C で 30 秒のアニーリング、および 98 °C で 45 秒の伸長を 40 サイクル行います。 統計的な堅牢性を確保するために、各サンプルを 3 回繰り返して評価しました。 遺伝子発現の相対定量化は、比較 Ct 法を使用して実行されました。この方法では、Ct 値は、統計的に有意な蛍光の増加が観察された点として定義されました。 蛍光強度がバックグラウンドレベルのすぐ上の閾値を超えるのに必要なPCRサイクル数(Ct)を、試験反応および参照反応について計算した。 GAPDH をすべての実験の内部対照として使用しました。
pDEST-CMV mCherry-GFP-LC3B WT (Robin Ketteler、Addgene プラスミド # 123230、ウォータータウン、マサチューセッツ州、米国からの贈り物) でトランスフェクトされた細胞をさまざまな処理にさらしました。 細胞を PBS で洗浄し、カバースリップを注意深く置き、わずかな圧力を加えて残っている気泡を取り除きました。 共焦点画像は、Andor BC43 Benchtop 共焦点顕微鏡 (Andor、ベルファスト、英国) を使用して単一線励起 (GFP の場合は 529 nm、または mCherry の場合は 600 nm) で取得しました。 画像は Fusion ソフトウェア (Andor) で取得し、Imaris ソフトウェア (Andor) で処理しました。
PPI ネットワーク分析は、相互作用遺伝子検索ツール (STRING) (https://string-db.org/) と ARN データベースを使用して実行されました。ARN データベースは、さまざまな証拠に基づいたオートファジー機構に関連するコンポーネント、その調節因子、転写をカバーしています。因子、miRNA 調節因子、シグナル伝達ネットワーク コネクターを多層図で示した 40。 ノード x の媒介中心性は、関数 g(x) を使用して計算されました。
ここで、 \({{{{{{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\) はノード s からノード t までの最短パスの総数であり、 \({{{{ {{\rm{\sigma }}}}}}}_{{st}}\left(x\right)\) は、ノード x を通過するパスの数です (x がエンドポイントではありません)。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 8週齢の野生型マウスとGdf15 KOマウスをビヒクルまたはCP(20 mg/kg、腹腔内)で72時間処理しました(n = 4〜5)。 動物を屠殺する前に、糞便サンプル (5 ~ 6 個、100 mg) を収集しました。 採取した便サンプルは、DNA 抽出前に -150 °C で保存しました。 メーカーの指示に従って、Exgene Stool DNA ミニキット (GeneALL、ソウル、韓国) を使用して、100 mg の糞便サンプルから微生物 DNA を抽出および精製しました。 抽出された DNA は、Qubit 蛍光光度計と高感度 dsDNA 試薬キット (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) を使用して定量されました。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 13 個の DNA サンプルを 16 S メタゲノム ライブラリー調製のための処理グループとしてプールしました。 16 S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を、プライマーセット (341 F、5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805 R、5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') および Illumina シーケンスアダプター (Illumina Inc. ) 以下のサイクル条件下で KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA Biosystems、米国ワシントン州ウィルミントン) を使用: 初期変性 95 °C で 3 分間、続いて 95 °C で 30 秒の変性を 25 サイクル、55 °C でのアニーリング°Cで30秒間、72°Cで30秒間の伸長、そして72°Cで5分間の最終伸長。 AMPure® XP ビーズ (Agencourt Biosciences、ビバリー、マサチューセッツ州、米国) を使用してアンプリコンを精製した後、BioAnalyzer (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州パロアルト) を使用して PCR 産物のライブラリー サイズを検証し、量を Qubit を使用して測定しました。蛍光計。 次いで、PCRアンプリコンを、Nextera XT Index Kit(Illumina,Inc.)を使用したインデックスPCRに供した。 PCR サイクル条件は次のとおりです。95 °C で 3 分間、続いて 95 °C で 30 秒の変性、55 °C で 30 秒のアニーリング、72 °C で 30 秒の伸長を 8 サイクル行い、最後に72℃で5分間伸長。 インデックス付き PCR アンプリコンは、AMPure® XP ビーズを使用して精製され、バイオアナライザーを使用してサイズが検証され、Qubit 蛍光光度計を使用して定量されました。 定量化されたアンプリコンは 4 nM に希釈され、2 × 150 bp ペアエンド シーケンス リードをターゲットとした Illumina iSeq プラットフォーム (Illumina, Inc.) での配列決定のためにプールされました。
この手順は、以前に公開された方法 68,69 に基づいています。 すべての配列は品質フィルターにかけられ、プライマーは Trimmomatic (v0.39)73 を使用して次のパラメーターでトリミングされました: LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36 SLIDINGWINDOW:4:15。 品質フィルターを通過したリードペアは、Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2、v2020.2) パイプライン 74 を使用してさらに分析されました。 DADA2 アルゴリズムを使用して、品質向上のためリバースリードの 34 塩基が切り詰められました 75。 次に、リードペアが結合され、ノイズが除去され、複製が解除され、キメラが除去されました。 ASV を参照するために詳細なデータが使用されました。 代表的な 16 S rRNA 配列は、99% の操作分類単位 (OTU) と SILVA rRNA データベース (v138) のプライマー領域でトレーニングされた QIIME2 ナイーブ ベイズ分類器を使用して分類グループに割り当てられました 76。 分類分類は、QIIME2 分類バープロット プラグインを使用して視覚化されました。 代表的な 16 S rRNA 配列を、MAFFT77、78 を使用してマスクされた多重配列アラインメントに供しました。 FastTree79 を使用して系統樹を構築しました。 OTU の存在割合 (相対存在量がサンプルの上位 30 位に入っている) を示すヒートマップは、R パッケージ QIIME2R (v0.99.22) を使用して生成されました。 豊富な OTU に基づく系統樹が構築され、MEGA X80 を使用した Jukes-Cantor 補正を備えた近隣結合アルゴリズムを使用して視覚化されました。 16 S rRNA 配列データセットは、PICRUSt2 を使用してさらに分析され、ムチン代謝に関連する酵素や経路などのメタゲノム関連機能が予測されました。
統計分析は、GraphPad Prism 6 ソフトウェア (GraphPad Software、La Jolla、CA、USA) を使用して実行されました。 スチューデントの t 検定を 2 つのデータ グループの比較分析に使用しました。 複数のグループを比較するために、データは事後 ANOVA 評価として実行される Newman-Keuls 法による分散分析 (ANOVA) の対象となりました。 ピアソンの相関分析を実行して、臨床データセットの相関係数 (R) を決定しました。 すべての評価は 2 つまたは 3 つの独立した実験の代表です。 生物学的複製およびアッセイの数の詳細は、図の凡例に示されています。
この動物実験は釜山国立大学施設内動物管理使用委員会(PNU-IACUC、釜山、韓国)(PNU-2019-2365)によって承認され、ヘルシンキ宣言および動物管理使用ガイドに基づいて実施されました。米国国立衛生研究所によって採用および公布された実験動物。
研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。
ソースデータは補足データで提供されます。 データは著者からのリクエストに応じて入手可能です。 この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 プライバシーまたは倫理上の制限により、一部のデータは利用できない場合があります。 クロップされていないウェスタンブロットは、補足図 s5 にあります。
適用できない。
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Kyung Hee Pyo (釜山国立大学、梁山、韓国) が提供してくださった動物治療の実験的支援に深く感謝します。 この研究は、教育省の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)を通じた基礎科学研究プログラム(2018R1D1A3B05041889)および韓国国立研究財団が管理する国際協力プログラムの枠組み(NRF-2022K2A9A1A01098067)によって支援されました。 、2022年度)。 TK の研究は、UKRI BBSRC 腸内微生物および健康研究所戦略プログラム BB/R012490/1 およびその構成プロジェクト BBS/E/F/000PR10353 および BBS/E/F/000PR10355 によって支援されました。 また、食料安全保障のためのゲノムのための UKRI BBSRC 中核戦略プログラム助成金 (BB/CSP1720/1) とその構成要素である作業パッケージ、BBS/E/T/000PR9819 および BBS/E/T/000PR9817 も含まれます。
これらの著者は同様に貢献しました: Navin Ray、Seung Jun Park、Hoyung Jung。
韓国、梁山市、釜山国立大学統合生物医科学部粘膜エクスポソームおよび生体調節研究室
ナビン・レイ、パク・スンジュン、ジョン・ホヨン、キム・ジュイル、ムン・ユソク
インペリアル・カレッジ・ロンドン医学部消化器疾患部門、ロンドン、英国
タマス・コルクスマロス
アーラム研究所、ノリッジ・リサーチ・パーク、ノリッジ、英国
タマス・コルクスマロス & ムーン・ユソク
クアドラム研究所バイオサイエンス、ノリッジ・リサーチ・パーク、ノリッジ、英国
タマス・コルクスマロス
韓国、梁山市、釜山国立大学ゲノムデータ科学大学院プログラム
ムン・ユソク
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YM はプロジェクトのデザインと仮説を定義しました。 NR、SJP、JK が実験を実施し、データを分析しました。 HJ はマイクロバイオーム データを分析しました。 TKはARNのネットワーク分析をサポートしました。 YMが原稿作成と監修を行いました。
ムン・ユソクさんへの対応。
著者らは競合する利害関係を宣言していません。
Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Stefan Reuter ともう一人の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Joao Valente。 査読ファイルが利用可能です。
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転載と許可
Ray、N.、Park、SJ、Jung、H. 他ストレス応答性 Gdf15 は、オートファジーおよび微生物叢の再プログラミングを介して腎腸毒性を抑制します。 Commun Biol 6、602 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1
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受信日: 2022 年 9 月 26 日
受理日: 2023 年 5 月 22 日
公開日: 2023 年 6 月 3 日
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04965-1
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