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Aug 02, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 366 (2023) この記事を引用

393 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

シナプス可塑性には、構造的および機能的マイクロドメインの適切な確立と再配置が含まれます。しかし、根底にある脂質の手がかりを視覚化することは困難であることが判明しました。急速凍結固定、膜凍結割断、免疫金標識、および電子顕微鏡を組み合わせて適用し、樹状突起棘およびそのサブエリアの原形質膜におけるホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸（PIP2）の変化と分布を視覚化し、定量的に決定します。超高解像度。これらの取り組みにより、長期うつ病 (LTD) の誘導中の PIP2 シグナルの異なる段階が解明されました。最初の数分間で、PIP2 は PIP5K に依存して急速に増加し、ナノクラスターを形成します。 PTEN は、PIP2 蓄積の第 2 段階に寄与します。一時的に増加する PIP2 信号は、脊椎の上部と中部の頭部に限定されます。最後に、PLC 依存の PIP2 分解により、LTD 誘導中に PIP2 合図が適時に終了します。合わせて、この研究は、LTD 誘導後のさまざまな段階で PIP2 によって設定される空間的および時間的手がかりを解明し、観察された PIP2 動態の根底にある分子機構を解剖します。

中枢神経系の興奮性シナプス後部の大部分は、樹状突起スパインと呼ばれる小さな樹状突起に位置しています。樹状突起スパインの構造と組織の動的な変化を伴うシナプス可塑性プロセスは、興奮性シナプス強度の調節の根底にあり、学習と記憶の基礎であると考えられています1,2。シナプス可塑性のモードの中で顕著なのは、長期抑制 (LTD) と呼ばれるプロセスであり、特定のシナプス信号に対する感度と応答が低下します 3。分子レベルでは、LTD には、エンドサイトーシスまたは側方拡散によるシナプス後密度足場からの α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソオキサゾールプロピオン酸 (AMPA) 型グルタミン酸受容体の構造再配列が関与します。アクチン細胞骨格によりスパインの体積が減少します3,4。

過去数十年の間に、樹状突起スパインの可塑性を制御し仲介するタンパク質機構の同定と特性評価において大きな進歩が見られました。しかし、膜脂質は主要な膜構成要素であるにもかかわらず、膜脂質の関与に関する知識はまだ少なく、物議を醸したり、矛盾したりすることがよくあります5、6。ホスホイノシチドは、異なる膜タンパク質と相互作用して制御し、さまざまな細胞機能を有することが知られています7。ホスファチジルイノシトール-4-リン酸 (PI4P) およびホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (ここでは簡単にするために PIP2 と呼びます) は、細胞内に最も豊富に存在するホスホイノシチドです。 PIP2 は原形質膜に豊富にあり、リン脂質の 1 パーセント未満を構成します 8。シナプス前では、ホスホイノシチドの重要な役割は十分に確立されており、主に膜輸送機能を構成しています9、10、11、12。対照的に、シナプス後における PIP2 の生理学的重要性と具体的な役割は、あまり理解されておらず、議論の余地があります。

個々のホスホイノシチドの濃度は、それ自体がさまざまなシグナル伝達経路の標的となる特定の脂質ホスファターゼ、キナーゼ、およびリパーゼの複雑なセットによって制御されます13、14。特にLTDにおけるPIP2の推定上の役割を調査した研究は、主にこれらの代謝酵素の操作に依存しており、矛盾する結果が得られました15、16、17、18、19、20。この（見かけの）不一致の理由としては、その分布や脂質キューとしての乱れのない利用性を変えることなく、シナプス後スパインで PIP2 を固定して直接視覚化することができないことが大きく含まれる可能性がある。

シナプスには、別個の膜ナノドメインによって確立されるように、区画化のための特定の機能的および構造的要求があります。さらに、これらのシナプス膜ナノドメインは、シナプス後再構成中に可塑的に適応する能力を必要とします。 LTD中のこれらの再配列は、重要なシグナル伝達分子PIP2によって設定された時間的および空間的合図によってもたらされる可能性があるという仮説に従うために、我々は、急速凍結固定、膜凍結破砕、免疫金標識および透過型電子顕微鏡（TEM）を適用して視覚化および定量的に評価した。樹状突起スパインの原形質膜およびそのさまざまなサブエリアにおける PIP2 の分布を超高解像度で観察します。これにより、LTD誘導後のさまざまな段階でPIP2によって設定される空間的および時間的合図を明らかにし、観察されたPIP2動態の根底にある分子機構を解剖します。

LTD 中の樹状突起脊椎膜における PIP2 シグナル伝達合図の関与を解明しようとした以前の研究では、矛盾した結果が得られました 16,19。明らかな不一致は、PIP2 分布の保存の欠如、人為的な PIP2 消光、不十分な分解能、および/またはその他の制限によって引き起こされた可能性があるため、急速に凍結保存された凍結破砕膜の抗 PIP2 免疫標識を確立することを目的としました。 TEMで分析しました。 PIP2、ホスファチジルセリン (PS)、PI(3,4,5)P3 (PIP3)、または PI(3,4)P2 のいずれかを添加したリポソームを液体窒素で冷却したプロパン/エタン中で急速凍結し、凍結破砕してインキュベートしました。抗PIP2および金結合二次抗体を用いて、膜環境においてシグナル脂質PIP2を保存および検出できるかどうかを検討する。実際、PIP2を添加したリポソームの電子顕微鏡検査では、頻繁な免疫金標識（29.32金粒子/μm2）が示されましたが、対照リポソームでは標識されませんでした（図1a〜d）。定量的評価により、PIP2を添加したリポソームは、対照リポソームと比較して12倍以上高い免疫金標識密度を示し、PS添加の形で無関係な負に帯電した脂質頭部基が過剰に提供されただけであることが示されました（図1e;補足図）。 1)。これらの結果は、周囲の無傷の脂質内で凍結保存された PIP2 を検出することが原理的に可能であることを明確に示しました。

a 65% (w/v) PE、30% (w/v) PC、および 5% (w/v) のいずれかの PI(4、 5)P2 (PIP2) (a)、PS (b)、PI(3,4,5)P3 (PIP3) (c)、または PI(3,4)P2 (d)。矢印は金ラベルの例を強調しています。バー、200 nm。 e 標識密度の定量分析。 PI(4,5)P2、n = 25; PS、n = 35; PI(3,4,5)P3、n = 21; PI(3,4)P2、n = 21 (e の定量的データの棒/点プロット表示については、補足図 1 を参照)。 f – o TEM画像（f、f'、f”、h – j、l – n）および体細胞の凍結破砕細胞膜の抗PIP2免疫金標識の定量分析（g、k、o）（f、f） '、f"、g) および海馬ニューロンの樹状突起 (h–n) (DIV14-16)。対照表面評価（E-face、氷）（g〜k）およびPIP2を含むリポソームとのプレインキュベーションによって特異的結合を消光した抗体を用いた対照実験（i、k）は、標識の特異性を実証しました。 (l-o) 抗 PIP2 抗体のさまざまな希釈を使用した追加の定量実験。飽和 PIP2 検出が得られる 1:100 の抗体希釈を確立します。バー、200 nm。相馬 P 面、n = 20。ソーマ E フェイス、n = 12。氷、n = 14 ROI。樹状突起: P 面、n = 40。 E 面、n = 37; 氷、n = 41; クエンチ (P 面)、n = 41 ROI。異なる抗体希釈で標識された樹状突起 (P 面): 1:200、n = 78。 1:100、n = 78; 1:50、n = 82 ROI。データ、それぞれ少なくとも 2 つの独立したアッセイの平均 ± SEM。統計的有意性の計算、一元配置 ANOVA/Tukey の多重比較検定 (g)、Kruskal-Wallis/Dunn の検定 (e、k、o)。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001。 P < 0.0001 の場合、正確な P 値は利用できません。他の P 値は図に直接報告されています。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

さらなる実験により、PIP3もPI(3,4)P2も抗PIP2抗体によって認識されないことが示された(図1c、d)。これらの追加のコントロールの両方で観察された標識密度は非常に低く、PSの標識密度を超えませんでした（図1e;補足図1）。したがって、一般的なイノシチドも、潜在的な抗原性の特徴をすべて含むホスホイノシチドも、PIP2 には存在しないが、追加のリン酸塩 (PIP3) を提供するもの、または PIP2 のすべての特徴を備えているが、異なる位置に 1 つのリン酸基を提示するホスホイノシチド (PI(3,4)) のいずれも存在しません。 P2) は抗 PIP2 抗体によって認識されました。したがって、確立された免疫検出は明らかに PIP2 に特異的でした。

さまざまなサイズの金コロイドでコーティングされた二次抗体を使用した標識密度の定量的決定により、凍結割断膜の抗PIP2免疫標識が金の粒子サイズに強く依存しないことが示されました（補足図2）。これは、凍結破砕膜におけるタンパク質ベースのプローブの立体障害が低いという以前の観察と一致していた 21。

繊細な形態ではありますが、サファイアディスク上で成長させた培養ニューロンは、原理的には凍結保存および凍結破砕が可能であり、F-BAR タンパク質シンダピン I22,23 (PACSIN 1) などの膜関連タンパク質の免疫金標識が可能になります。 N-Ank タンパク質 ankycorbin24 (RAI14)。サファイア上で 16 日間培養したラットの初代ニューロン (DIV16) は、樹状突起、樹状突起スパインおよびその下部構造を含む正常なシナプス後形態を示しました 22。したがって、膜タンパク質の凍結保存、凍結破砕、免疫金標識およびTEMの組み合わせを、天然の細胞膜環境におけるシグナル脂質PIP2の検出に実質的に拡張できるかどうかをテストしました（図1f〜k）。体細胞の凍結破砕した原形質膜領域を高倍率で観察すると、抗PIP2免疫金標識が頻繁に見られました（図1f-f"）。免疫金標識はさまざまな膜トポロジーで見つかり、ある程度クラスター化されていました。標識のクラスター検出される標識は通常、100 nm 以下の比較的均一な直径を持ち、最大 10 個の標識が含まれていました (図 1f-f")。

細胞質界面を表す膜の P 面 (破壊された原形質膜の原形質面) は 24.2 金粒子/μm2 の平均標識密度を示したのに対し、標本内の固有の対照表面の標識は非常に低かったため、標識は非常に特異的でした。密度（細胞体E面（破壊された細胞膜の外質面）、3.0 /μm;2氷、0.6/μm2）（図1g）。これらの観察は、PIP2 が細胞膜の内側リーフレットに主に存在することと一致しています 25。

驚くべきことに、同じ標本と免疫標識において、樹状膜領域のPIP2標識密度は、体細胞膜の非常に豊富な標識よりもはるかに低かった（図1h-k）。樹状膜領域では、標識密度はわずか 6.3 粒子/μm2 に達しました。したがって、それは体細胞膜領域の約 4 分の 1 に過ぎません。

重要なのは、樹状突起の E 面と氷の表面の両方がほとんど標識を示さなかったため、このはるかに低い樹状突起 PIP2 検出も明らかに特異的であったことです。さらに、PIP2含有リポソームを用いた抗体消光実験でも、凍結割断された樹状細胞膜の標識が非常にまばらになりました（図1i〜k）。

PIP2 シグナルの発生、強度、ダイナミクス、減衰を超高解像度で確実に研究するためには、次に、抗体過剰による推定上の非特異的結合を生じることなく、最大量の PIP2 を検出する抗体希釈率を決定することが重要でした。同じ凍結割断レプリカのアリコートを異なる抗体希釈液でインキュベートすると、1:100 で飽和に達することが観察されました (図 1l–o)。

検証され最適化された抗 PIP2 標識により、次に成熟海馬ニューロンの樹状突起の凍結保存および凍結破砕された原形質膜領域における摂動のない PIP2 局在の定量的超高分解能検査を行うことが可能になりました。以前に実証したように、凍結割断およびその後の電子顕微鏡用サンプル調製中に樹状突起だけでなく樹状突起スパインも保存し、それらを分類して異なるサブクラスに割り当てることは原理的に可能です22。私たちは、マッシュルーム型スパイン、つまり頭部が明確に識別できるスパインに定量分析を集中させました。なぜなら、マッシュルームスパインは脳内のスパインの大部分を占め、成熟したシナプス後構造を含み、したがって生理学的に最も重要であるからです1,2（以下では単にスパインと呼びます)。樹状突起から突き出た線条状の樹状突起スパインとその下部構造は、十分な速度で凍結破壊することが判明し、抗PIP2免疫標識されました（図2a〜c）。定量的分析により、体系的にサンプリングされたスパイン（つまり、ゼロプロファイルも含まれる）の抗PIP2免疫標識密度が、隣接する樹状領域の平均標識密度よりも高いことが示されました（P = 0.0062）（図2d）。

a – c 凍結骨折した海馬ニューロン（DIV16）の抗PIP2免疫金標識樹状突起スパインのTEM画像（a、b）。スパインの輪郭が描かれ、樹状突起（青）、スパイン基部（緑）、スパインネックが透明に着色されています。 (a) (c に概略的に示す) (黄色)、および脊椎頭部 (赤色)、および対応する生の TEM 画像 (b)。バー、200 nm。 d、e それぞれ、樹状突起対樹状突起スパイン細胞膜領域（d）およびサブスパイン領域（e）の抗PIP2免疫金標識密度の定量分析。データ、16 の独立したアッセイの平均 ± SEM。 n = それぞれ 159 ROI (樹状突起、脊椎全体、脊椎基部、首、頭)。統計的有意性の計算、Mann-Whitney (d) および Kruskal-Wallis/Dunn's (e)。 **P < 0.01; ****P < 0.0001。 P < 0.0001 の場合、正確な P 値は利用できません。他の P 値は図に報告されています。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

脊椎内では、脊椎頭部は首、特に基部にわたって PIP2 の高度な濃縮を示しました (両方とも P < 0.0001; ****)。安静時の脊椎頭部の平均抗 PIP2 免疫標識密度は 6.5 ± 0.6 粒子/μm2 であったのに対し、基部と頚部ではそれぞれ 2.9 ± 0.7 粒子/μm2 および 4.6 ± 1.3 粒子/μm2 でした。したがって、脊椎頭部細胞膜における PIP2 の標識密度は、脊椎基部領域の標識密度の 2 倍以上でした。 (図2e)。

これらの顕著な違いは、定常状態であっても、特に樹状突起スパインの頭部が、成熟ニューロンの樹状突起における PIP2 シグナルの顕著な領域であることを明らかにしました。

50 μM N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) との最大 3 分間のインキュベーションおよびシナプス前サイレンシング (2 μM テトロドトキシン (TTX) プレインキュベーション)26,27,28,29,30,31 とそれに続く追跡による LTD の誘導前処理した培地での期間とその後の異なる時間枠での急速凍結により、LTD誘導の前後に樹状突起だけでなく樹状突起スパインでもPIP2が検出できることが実証されました（図3a〜h）。定量的な電子顕微鏡評価により、樹状突起領域（樹状突起スパインの周囲であっても）のPIP2標識密度は時間の経過とともに大きく変化しなかったが（図3i）、樹状突起スパインの原形質膜はPIP2の急速かつ統計的に非常に有意な増加を示したことが明らかになりました。密度 (P = 0.0049 (**)) NMDA 刺激開始 2 分。この最初の段階での樹状突起スパインのPIP2レベルは、NMDAによるLTD誘導前のPIP2レベルの180％に達しました（図3j）。

a-h 定常状態（0分）および50 µM NMDAとのインキュベーションによるLTD誘導中および誘導後のさまざまな時点での、凍結骨折した海馬ニューロン（DIV14-16）の抗PIP2免疫金標識樹状突起棘（輪郭線）のTEM画像（概要） 3分間静置し、その後前調整した培地に戻します。バー、200 nm。 i-k LTD 誘導中および誘導後のさまざまな治療時間における抗 PIP2 免疫金標識密度の定量的測定。樹状突起 (i)、スパイン全体 (j)、および 3 つの異なるスパインサブドメイン (k) で測定され、平均値のパーセントとして表されます。各アッセイにおける 0 分 (定常状態) での合計脊椎データの標識密度。 LTD 誘導中および誘導後の樹状突起スパインにおける PIP2 シグナル伝達応答の 3 つの明らかな段階が、着色によって強調表示されます (黄色、第 1 段階、PIP2 密度の急速な最初の増加、緑色、スパイン (頭部) 細胞膜における PIP2 シグナルの増加の第 2 段階。 10 分で最大値に達します;青、フェーズ 3、その後脊椎 (頭部) の PIP2 信号が減少します)。それぞれの対照に対して正規化されていない0分および3+7分の絶対データと、独立した訓練を受けていない実験者から得られた対応するデータとの比較については、補足図3を参照してください。（i – k）データ、平均±SEM。 0分、n = 159; 1分、n = 36; 2 分、n = 53。 3 分、n = 49。 5 (3 + 2) 分、n = 50; 10 (3 + 7) 分、n = 59; 15 (3 + 12) 分、n = 44; 30 (3 + 27) 分、n = 35 の ROI (樹状突起、脊椎全体、脊椎サブドメイン、基部、首、頭部) を、異なるインキュベーション時間での 3 ～ 16 の独立したアッセイから得ました。統計的有意性の計算、Kruskal-Wallis/Dunn's (i-k; **P < 0.01; ****P < 0.0001) および 3 vs. 10 分および 10 vs. 30 分の Mann-Whitney 検定 (j; ## P < 0.01) (j)。 P < 0.0001 の場合、正確な P 値は利用できません。他の P 値は図に直接報告されています。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

この最初の段階に続いて、PIP2 レベルのゆっくりとした 2 回目の増加が起こり、LTD 誘導の開始から 10 分後にピークに達しました。脊椎全体にわたって、この第 2 段階の最大値は、定常状態の PIP2 レベルの 2 倍（220%）を超える高さの PIP2 信号によって特徴付けられました（図 3j）。この重要な発見は、その後、独立した実験者による追加の評価によって確認されました。重要なのは、このような努力により、脊椎の選択、脊椎領域の決定、およびラベリング数について実質的に同じデータが得られ、したがってラベリング密度の実質的に同一のデータも得られたことです（補足図3）。

その後、PIP2 レベルは低下しました。 30 分後、ほぼ治療前のレベルに達しました。したがって、この減少は、樹状突起スパインにおけるLTD誘導時のPIP2シグナルの別の、第3の異なる段階を構成しました（図3j）。

興味深いことに、より詳細な空間調査により、それぞれの 0 分のデータに正規化した場合、フェーズ 1 とフェーズ 2 の両方で PIP2 レベルの増加を示したのは脊椎頭部の膜のみであり、脊椎基部または首の膜領域ではないことが明らかになりました (図3k）。脊椎頭部膜では、PIP2 標識密度は、フェーズ 1 では定常状態レベルの 230% 以上、フェーズ 2 では 3 倍以上でした (図 3k)。

脊椎基部と脊椎を取り囲む樹状膜領域はどちらも、LTD 誘導の後期段階で脊椎膜領域からの PIP2 の 2D 拡散を示す PIP2 レベルの増加傾向を示しましたが、これらの傾向はいずれも軽微であり、統計的には残っています。重要ではありません（図3i、k）。フェーズ3における脊椎全体のPIP2レベルの全体的な低下（図3j）は、主に脊椎頭部のPIP2レベルの変化に起因していました。 LTD誘導の開始から30分後、脊椎頭部膜のPIP2レベルは治療前のレベルに戻りました（図3k）。

脊椎の頭部は LTD 中にさまざまな構造変化を受けますが、これには異なる脊椎サブドメインが関与している可能性があると考えられています。各脊椎頭部の高さを測定し、それを3つの等しい幅のゾーンに分割すると（図4a）、PIP2シグナルの分布は均等ではなく、3つの頭部サブドメインで非常に異なる挙動と動態を示すことが明らかになりました。 NMDA 治療後の顕著な PIP2 の増加が頭上部に見られました (図 4b)。 PIP2 信号は、第 1 段階で定常状態の信号の約 250% まで急速に上昇しました。第 2 段階でも引き続き 350% 以上まで上昇しました。同様に、PIP2レベルの強い増加が頭部中央領域で観察されました（図4c、補足図3k、l）。

脊椎の頭部は、図式 (a) に従って、下部、中部、上部の頭部にさらに分割されました。 NMDA処理後のDIV14-16ニューロンのPIP2標識密度の定量分析（図3を参照）、上部（b）、中央（c）、および下部頭部（d）。定量分析は、各アッセイの 0 分 (定常状態) での合計脊椎データに基づいています。それぞれのコントロールに対して正規化されていない 0 分および 3 + 7 分の絶対データと、独立した訓練を受けていない実験者から得られた対応するデータとの比較については、補足図 3 を参照してください。0 分、n = 159。 1分、n = 36; 2 分、n = 53。 3 分、n = 49。 5 (3 + 2) 分、n = 50; 10 (3 + 7) 分、n = 59; 15 (3 + 12) 分、n = 44; 30 (3 + 27) 分、n = 35 個の ROI (上部、中部、下部頭部) を、異なるインキュベーション時間で 3 ～ 16 回の独立したアッセイで実行。データ、平均±SEM。統計的有意性の計算、Kruskal-Wallis/Dunn の計算。 *P < 0.05; **P < 0.01。 P 値は図に直接表示されます。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

脊椎頭部上部膜領域の動態は、フェーズ1およびフェーズ2中に比較的連続的なPIP2レベルの上昇を示したため、独特でした（図4b〜d）。さらに、フェーズ3でのPIP2レベルの低下は、上部脊椎頭部膜区画のデータと比較した場合、中部および下部頭部ではるかに低いレベルに達しました（図4b〜d）。

これらの観察は、LTD 関連の PIP2 動態が脊椎頭部のサブコンパートメントで異なることを示唆しました。脊椎頭部の上部および中部の膜領域の増加は、PSD での AMPA 受容体の利用可能性および/または脊椎頭部の構造変化の開始の調節における PIP2 の重要性を反映している可能性があります。

PIP2 は、シナプス AMPA 受容体の固定および/または AMPA 受容体のエンドサイトーシスに関与していることが示唆されています 32。残念ながら、AMPA および/または NMDA 受容体、クラスリンやダイナミンなどのさまざまなエンドサイトーシス成分、および PSD95 や ProSAP/Shank タンパク質などのシナプス後足場タンパク質の二重免疫金標識は、成功した PIP2 とともに確立されていません。検出に失敗しました。これらの困難と一致して、NMDA 受容体と AMPA 受容体の両方が膜形成後の細胞外側で検出され 33,34,35,36,37 、膜に間接的または単に末梢的に結合しているだけで挿入されていないタンパク質を検出するのは困難である。これはおそらく、そのような物質を効果的に除去することによって膜への完全なアクセスを提供するサンプル前処理手順によるものです。 PIP2 シグナル伝達が関与する細胞生物学的プロセスは、おそらく脊椎膜にあるある種の PIP2 が豊富なナノドメインに依存していると考えられます。実際、我々は、培養ニューロンの凍結保存され、凍結破壊された原形質膜においてPIP2クラスターを観察することができた（図5a）。

NMDAで3分間処理した初代海馬ニューロンの、凍結保存し、凍結骨折し、抗PIP2免疫金標識した脊椎のTEM画像の例。脊椎頭部のクラスター化された (直径 100 nm の円形 ROI 内に n ≥ 3 個の金粒子) および (より多くの) 分散した抗 PIP2 シグナルは、それぞれ円と矢印でマークされています。バー、200 nm。 b クラスター外のラベルと比較した、クラスター内で見つかったスパインヘッド内の抗 PIP2 免疫金標識の分布の定量化 (スパインヘッド膜で見つかった総標識のパーセント)。 NMDA 処理開始後 2 分および 3 分でクラスタリングが一時的に増加することに注目してください。データ、平均±SEM。 0分、n = 159; 1分、n = 36; 2 分、n = 53。 3 分、n = 49。 5 (3 + 2) 分、n = 50; 10 (3 + 7) 分、n = 59; 15 (3 + 12) 分、n = 44; 30 (3 + 27) 分、n = 35 の ROI (脊椎頭部)、それぞれ異なるインキュベーション時間の 3 ～ 16 の独立したアッセイから。二元配置 ANOVA/Šídák の多重比較検定 (0 分までの比較)。 *P < 0.05; ***P < 0.001。 P 値は図に直接表示されます。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

このようなクラスターの頻度とクラスター化された PIP2 の相対的な割合は両方とも定常状態では低かったが、ニューロンが NMDA で刺激されると大幅に増加した。脊椎頭部の詳細な定量分析により、定常状態でクラスター内で検出されたのはすべての抗 PIP2 標識のわずか 22.4% であることが明らかになりました (図 5b; 0 分)。対照的に、NMDA 処理開始から 2 分という早い時点で、すべての PIP2 標識の 57.6% がクラスター内で見つかりました (図 5b; 2 分)。

驚くべきことに、直径 100 nm 未満の膜ナノドメイン (ほとんどは約 50 nm) の内部で PIP2 が統計的に有意かつ優勢に発生するため、PIP2 クラスター化は主に脊椎頭部における PIP2 の急速な増加の短命かつ初期の現象であるように見えました。）は、LTD誘導の開始後2分および3分のみに観察されました（図5b）。

驚くべきことに、NMDA治療終了からわずか数分後には、脊椎頭部で現在強く上昇しているPIP2（図3kと比較）は、定常状態の分布と同様に、ほぼ分散して分布していた（図5b；同様の分布を比較）。それぞれ0分、3 + 2分、3 + 7分）。また、ＬＴＤ誘導後のＰＩＰ２レベルの低下を反映する最終段階（１５分および３０分）では、ＰＩＰ２クラスタリングに統計的に有意な変化は示されなかった（図５ｂ）。

したがって、LTD誘導性のPIP2シグナル伝達の第2段階は、樹状突起脊椎頭部における最高レベルのPIP2によって特徴づけられ（図3、4）、LTD誘導の初期段階と比較した場合、完全に異なるPIP2の分布を示した。

染色体10上で欠失したホスファターゼおよびテンシンホモログ（PTEN）は、LTD誘導後にPSDにリクルートされることが示されており、LTD中のPIP2シグナルはPIP3脱リン酸化によって生成されることが示唆されました17（図6a）。ビスペロキソバナジウム化合物はタンパク質チロシンホスファターゼを阻害しますが、特に bpV(HOpic) は低濃度で PTEN に対する選択性を示しました 38。 LTD誘導中にPIP2シグナルのさまざまな段階で観察された樹状突起スパインにおけるPIP2蓄積の背後にある分子機構についての洞察を得るために、NMDAによるLTD誘導の前にPTEN阻害剤bpV(HOpic)とともに60分間インキュベートしたニューロンを調べた(図6b-j)。

a LTD および bpV(HOpic) による阻害中の PIP2 への推奨ルートを視覚化したスキーム。 b – g ビヒクルコントロールとしてddH2Oで60分間前処理したDIV14-16海馬ニューロン（b – d）または15 nM bpV（HOpic ）（e-g）、NMDA誘発LTDに2分間（c、f）、および3分間NMDAに続いて7分間のポストインキュベーション時間（d、g）に曝露し、NMDA処理されていない対照（0分）と比較しました。（なれ）。バー、200 nm。 h 同じアッセイにおける、単に ddH2O 処理したニューロン (-bpV(HOpic)) と比較した、bpV(HOpic) で前処理したニューロンの抗 PIP2 標識密度の定量分析では、基底 PIP2 レベルに対する PTEN 阻害の統計的に有意な効果は明らかにされませんでした。。標識密度は、それぞれの bpV(HOpic) コントロールに対して正規化されました。 i、j それぞれ脊椎全体（i）および脊椎頭部（j）におけるLTD誘導の第1相および第2相中のPIP2シグナル伝達の定量分析（両方とも総脊椎標識密度のそれぞれの0分データに正規化） 2 つの条件のそれぞれ、つまり阻害剤ありとなし）。データ、平均±SEM。 −bpV(HOpic)、0分、n = 39; 2 分、n = 29。 10 (3 + 7) 分、n = 33 の ROI (合計脊椎、脊椎頭部) および +bpV(HOpic)、0 分、n = 33。 2 分、n = 30。 10 (3 + 7) 分、3 つの独立したアッセイからの一次ニューロンの各 n = 27 ROI (合計スパイン、スパインヘッド)。マン・ホイットニー (h); ±bpV(HOpic) 条件 (i, j) 間の二元配置分散分析/ボンフェローニ多重比較。 *P < 0.05。追加のクラスカル・ウォリス/ダン多重比較は、2 分および 3 + 7 分と 0 分の対照データ (i、j) #P < 0.05; の + および -bpV(HOpic) データの比較のために実行されました。 ##P < 0.01。 P 値は図に直接表示されます。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

定常状態（0分）では、bpV（HOpic）による処理は、溶媒対照（ddH2O; -bpV（HOpic））による前処理と比較して、樹状突起スパインにおけるPIP2レベルに有意な差を生じませんでした（図6h）。また、PIP2の上昇第 1 相のレベル（2 分間の NMDA 処理で表される）は、全脊椎細胞膜領域（図 6i; 定常状態の 235%; P = 0.0148）および脊椎頭部細胞膜領域（図.6j; 定常状態の 269%; P = 0.0321)。

LTD誘導のPIP2ダイナミクスのbpV(HOpic)非感受性の第1段階とは対照的に、PIP2ダイナミクスの第2段階(3分NMDA+7分で表される)はPTEN阻害の影響を受けることが判明した。 PTEN 阻害を受けなかったニューロンの脊椎膜の PIP2 密度は定常状態の PIP2 レベルの 246% であり、それにより 0 分の値とは統計的に有意に異なりました (P = 0.0020) (図 6i)。 PTEN阻害剤とともに3+7分でプレインキュベートしたニューロンの樹状突起スパインの原形質膜は、むしろ0分のデータに似ていました（図6i）。

PIP2 動態の第 2 段階における bpV(HOpic) の阻害効果は、脊椎頭部膜で特に顕著でした。ここで、PIP2レベルは、0分と比較した場合、非阻害剤処理対照ニューロンにおいて3+7分で強く上昇しました（図6j; 297％; P = 0.0131）。対照的に、bpV(HOpic)で前処理したニューロンでは、3 + 7 分の PIP2 レベルは 0 分のデータの約 150% に過ぎず、したがって脊椎頭部で得られた約 2 倍高い 3 + 7 分のデータとは統計的に有意に異なりました。 PTEN阻害を受けていないニューロンの膜領域（図6j; P = 0.0259）。

したがって、LTD誘導におけるPIP2シグナルの初期段階はPIP3脱リン酸化によるPIP2供給から完全に独立しているのに対し、PTENの酵素活性は特に樹状突起スパイン頭部におけるLTD媒介PIP2蓄積の第2段階に強く寄与している。

真核生物では、PIP2はホスファチジルイノシトール-4-リン酸-5-キナーゼ（PI4P5K/PIP5K）によるPI4Pのリン酸化によって頻繁に生成されます（図7a）。 PIP5K のさまざまなアイソザイムの中で、PIP5Kγ は脳内で高い発現を示します 39。 UNC3230 は後根神経節ニューロンの PIP5Kγ40 を選択的に阻害し、市販されている唯一の PIP5K 阻害剤です。したがって、我々はUNC3230を使用して、LTD誘導中のPIP2シグナルのさまざまなフェーズ中のPIP2の発生源をさらに分析しました（図7b-g）。 500 nM UNC3230による海馬ニューロンの16時間の前処理は、溶媒対照と比較した場合、定常状態（t = 0分）でのPIP2レベルに対する統計的に有意な効果をもたらさなかった（図7h）。

LTD および PIP5K 阻害剤 UNC3230 による阻害中の PIP2 への推奨ルートを視覚化したスキーム。 b–g 抗PIP2免疫標識し、凍結骨折したDIV14-16海馬ニューロンの樹状突起スパインのTEM画像。ビヒクルコントロール（0.002％DMSO）（-UNC3230、b–d）または500 nM UNC3230で前処理しました（ e〜g）それぞれ2分間のNMDA（50μM）または3分間のNMDAと7分間の回復時間（3+7分）でLTDを誘導する前、または定常状態（0分）で細胞を凍結保存する前。バー、200 nm。 h 定常状態における +UNC3230 および -UNC3230 ニューロンの抗 PIP2 標識密度の定量分析は、それぞれの未処理対照に対して正規化されました。 i、j PIP2ダイナミクスの定量分析は、LTD誘導中のPIP2シグナル上昇の第1相（2分）と第2相（3+7分）の両方に対するPIP5K阻害の非常に強い負の影響を明らかにしています。データ、平均±SEM。 −UNC3230、0分、n = 62; 2 分、n = 46。 10 (3 + 7) 分、n = 35 の ROI (合計脊椎、脊椎頭部) および + UNC3230、0 分、n = 50。 2 分、n = 40。 10 (3 + 7) 分、3 つの独立したアッセイからの一次ニューロンの各 n = 34 ROI (合計スパイン、スパインヘッド)。マン・ホイットニー (h; ns); ±UNC3230 条件間の二元配置分散分析/ボンフェローニ多重比較 (i, j) *P < 0.05。 **P < 0.01。 2 分および 3 + 7 分の +UNC3230 および -UNC3230 データと 0 分の対照データを比較するための追加のクラスカル・ワリス/ダン多重比較 (i, j)#.P < 0.05; ##P < 0.01。 P 値は図に直接表示されます。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

対照的に、PIP5Kγ を阻害すると、LTD 誘導中の PIP2 動態の第 1 相 (2 分) と第 2 相 (3 + 7 分) の両方で PIP2 増加が完全にブロックされました。両方の段階での LTD 誘発 PIP2 蓄積のこの効果的なブロックは、+ 条件と -UNC3230 条件の間の明確で統計的に有意な差によって強調されました。樹状突起スパインにおけるLTD誘発性のPIP2ダイナミクスの完全な障害は、スパイン全体（図7i）またはスパインヘッドの膜領域のみを検査したか（図7j）に関係なく、明らかでした。すべての +UNC3230 条件で、PIP2 レベルは定常状態 (0 分) に等しいままでした (図 7i、j)。

したがって、PIP5Kγ は明らかに NMDA 誘導による LTD 誘導中の PIP2 生成において極めて重要であり、PTEN の第 2 相選択的寄与とは対照的に、PIP5Kγ は LTD 誘導中の PIP2 シグナルの初期段階の両方で絶対的に重要であることが明らかになりました。私たちの定量分析。

樹状突起スパインにおけるLTD誘導性のPIP2動態を理解するためには、LTD誘導中のPIP2動態の第3段階で樹状突起スパインの細胞膜領域からPIP2を効果的に除去する分子機構を調べることが次に重要であった。脊椎頭部領域からの PIP2 の拡散に加えて、いくつかの酵素が PIP2 を変換する反応を触媒します。最も顕著には、ホスホリパーゼ C (PLC) が PIP2 をジアシルグリセリン (DAG) とイノシトール-1,4,5-三リン酸 (IP3) に切断します (図 8a)。したがって、溶媒対照（ジメチルスルホキシド（DMSO））と比較して、一次海馬ニューロンをPLC阻害剤U-7312241で処理し、LTD誘導の有無にかかわらずPIP2レベルを調べました（図8b-j）。 U-73122は、LTD誘導の前にPIP2標識密度の変化をもたらさず（図8h）、10分後（3 + 7分）でも、LTD誘導の初期段階でのPIP2レベルの急速な増加を変化させませんでした（図8h）。）PIP2レベルは、それぞれ阻害剤で処理されていない樹状突起スパインおよび樹状突起スパイン頭部のレベルと同様のままでした（図8i、j）。

DAG + IP3を生成するPIP2の分解と、PLC阻害剤U-73122による阻害を視覚化したスキーム。 b–g 抗PIP2免疫標識し、凍結骨折したDIV14-16海馬ニューロンの樹状突起スパインのTEM画像。ビヒクルコントロール（0.2％DMSO）（-U-73122、b–d）または10で前処理しただけです。 μM U-73122 (e-g) それぞれ、3 分の NMDA および 7 分の回復時間 (3 + 7 分) および 3 分の NMDA および 27 分の回復時間 (3 + 27 分) によって LTD を誘導するか、または放置する前定常状態(0分)の細胞。バー、200 nm。 h 定常状態における + U-72122 および -U-73122 ニューロンの抗 PIP2 標識密度の定量分析は、それぞれの未処理対照に対して正規化されました。 (i、j) PLC 阻害は、LTD 誘導の第 2 相 (3 + 7 分) では PIP2 レベルに影響を及ぼさないが、第 3 相では定常状態の PIP2 レベルの回復を完全にブロックすることを示す PIP2 動態の定量分析 (3 + 27 分)、LTD 誘導中の PIP2 ダイナミクス。データ、平均±SEM。 −U-73122、0分、n = 28; 3 + 7 分、n = 27; 3 + 27 分、n = 32 の ROI (合計脊椎、脊椎頭部) および +U-73122、0 分、n = 27。 3 + 7 分、n = 25; 3 + 27 分、3 つの独立したアッセイから得られた一次ニューロンの n = 26 ROI (合計スパイン、スパインヘッド)。マン・ホイットニー (h; ns); ±U-73122 条件 (i、j) 間の二元配置分散分析/ボンフェローニ多重比較。 *P < 0.05; **P < 0.01。 3 + 7 分および 3 + 27 分での +U-73122 および -U-73122 データを 0 分の対照データと比較するための追加のマン・ホイットニー検定 (i、j)。 #P < 0.05; ##P < 0.01; ###P < 0.001。 P 値は図に直接表示されます。数値ソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

対照的に、LTD誘導中のPIP2シグナル伝達の第3段階は、PLC活性に完全に依存していることが判明した。 30分後、対照樹状突起脊椎細胞膜領域および対照脊椎頭部膜領域は、一過性のLTD誘導性PIP2増加の完全な逆転を示しましたが、U-73122によるPLC阻害はこの減少を完全にブロックしました。 30分時点で、脊椎原形質膜領域全体と脊椎頭部膜領域の両方における抗PIP2標識密度は、非常に高いレベルで持続した(図8i、j)。

これらの結果は、樹状突起スパイン頭部膜におけるLTD誘導性のPIP2シグナルが、PLCによるPIP2分解によって能動的に停止されることを明らかに明らかにした。まとめると、我々のデータは、樹状突起スパインの原形質膜におけるPIP2シグナルの一時的な増加を明らかにし、これらのシグナルの動態を強調し、スパインヘッド膜領域におけるLTD誘発性のPIP2シグナルの動態において重要な役割を果たす分子機構を解明する。

ホスホイノシチドから発せられるシグナル伝達合図は、さまざまな細胞機能の重要な側面と考えられていますが、これらの時間的および空間的合図を細胞膜で視覚化して研究することは非常に困難です。ここでは、我々の知る限りでは初めての PIP2 の超高分解能免疫検出について説明します。私たちの分析は、シナプス可塑性における PIP2 シグナルを追跡するために必要な、神経細胞のシナプス後コンパートメントの原形質膜における PIP2 に関する定量的な空間的および時間的情報を提供します。驚くべきことに、非神経細胞におけるPLCのPHドメインの精製GST融合タンパク質を用いた豊富なPIP2検出と一致する、ニューロン細胞体の原形質膜領域で見出されるPIP2レベルと比較して21、42、43、PIP2樹状樹の原形質膜中のレベルは一般に非常に低かった。したがって、樹状突起コンパートメントでは、PIP2 は本物のシグナル伝達合図として機能すると考えられます。

Horne と Dell'Acqua は、光学顕微鏡と PLC の PIP2 消光 PH ドメインをタンパク質プローブとして使用し、樹状突起と比較して樹状突起スパインでは PIP2 が非常に豊富であることを示唆しました 16。我々の定量的測定により、凍結割断法を使用することにより、定常状態における樹状突起スパインにおけるPIP2の濃縮は実際には小さいことが示された。私たちの電子顕微鏡検査により、スパインヘッド膜だけが一般的な樹状突起レベルを超える強力な濃縮（約+40%）を示したことが明らかになりました。

超解像法は、PC12 細胞における PIP2 の検出に適用されています 44,45 が、神経細胞の樹状突起スパインの下部構造は非常に小さいため、これらの下部構造との詳細な相関関係を調べるには光学顕微鏡の用途は限られています。重要なのは、PLC-PH などのレポータータンパク質の外因性発現は、PIP2 プローブとして広く使用されているものの、PIP2 レベルの変化を明確に報告するわけではありません。これは、PLC-PH が PIP2 の細胞内分解産物の増加によって PIP2 から置き換えられることが示されているためです。 IP36、46。細胞における PIP2 の半減期はわずか約 1 分であるため、この制限は深刻です 47,48。さらに、PLC-PH 発現は、PIP2 分解酵素 PLC と競合し、PIP2 シグナルを消光することにより、細胞生理機能とシグナル伝達に影響を与えます 49,50。これは、PIP2 に結合した PLC-PH が、エンドサイトーシス、細胞骨格、および PIP2 エフェクタータンパク質の結合と競合するためです。シグナリングコンポーネント7 により、PIP2 信号の適切な認識と送信が妨げられます。重要なことは、化学的固定手順は脂質シグナルの生理学的分布を妨げる傾向があるということです50,51。非常に迅速な凍結保存、凍結割断、炭素と白金の蒸発による膜成分の不可逆的安定化、膜レプリカの免疫金標識、および TEM 検査の組み合わせにより、これらの以前の制限がすべて克服され、LTD 中の PIP2 シグナルが明確に表示されます。

相対的な PIP2 レベル、分布および組織の定量的評価、およびさまざまな阻害剤の研究により、LTD 中の PIP2 シグナル伝達が規定のパターンで発生することが明らかになりました。まず、NMDA 適用による LTD 誘導の最初の 2 分以内に PIP2 レベルの急速な増加が観察されました。脊椎頭部の膜領域では、この最初の増加は、PIP2 の定常状態レベルのほぼ 250% に達しました。 LTD 誘導における PIP2 の役割は、PIP2 分解酵素であるイノシトールポリリン酸 5-ホスファターゼを細胞膜に移動させる化学的に誘導された二量体化により、細胞膜で PIP2 が枯渇し、低周波刺激19．私たちが決定した初期の LTD 誘導中に観察された PIP2 の増加は、NMDA 刺激の 1 分後の樹状突起スパインにおける PIP2 濃度の低下の観察とは顕著な対照を成しています 16。しかし、それぞれの矛盾するデータは、蛍光顕微鏡法と GFP タグ付き PLC-PH の過剰発現を使用して得られたものであるため、すでに上で説明したすべての技術的および科学的制限の影響を受けました。凍結割断膜の超高解像度研究で観察された樹状突起スパインの原形質膜におけるPIP2レベルの強い増加は、特にスパイン頭部の原形質膜領域に局在していた。 LTD は主に脊椎頭部の受容体とアクチン細胞骨格の再構成に関与していると考えられているため、脊椎頭部における PIP2 のこの急速な増加は、LTD の誘導における PIP2 の役割と一致しています 1、2、3、4。

驚くべきことに、LTD 中の PIP2 シグナルの最初の数分は、PIP2 の統計的に有意なクラスター化が見られた唯一の時間でもありました。 PIP2 クラスターはクラスリン媒介エンドサイトーシスで観察されています 32。 PIP2 は、エンドサイトーシスに関与するさまざまなタンパク質に結合し、エンドサイトーシスでコーティングされたピットの構築を開始および維持するために不可欠です 52、53、54、55、56、57、58、59。初期のエンドサイトーシス部位における PIP2 のクラスター化は、エプシンや BAR ドメイン含有タンパク質などのタンパク質の局所濃度を動員して増加させる可能性があり、これが膜変形やエンドサイトーシス小胞の形成に寄与する可能性があります 60,61。

NMDA 媒介 LTD 誘導は、刺激後の最初の数分間の AMPA 受容体エンドサイトーシスによって特徴付けられ 31,62,63 、この内部移行はシナプス周囲領域で優先的に起こると考えられています 63。これらの観察は、我々が決定した樹状突起スパインにおけるPIP2シグナルの時間枠と、特に我々の詳細な研究で観察されたLTD誘導後の樹状スパイン頭部の上部および中部細胞膜領域における強く上昇したPIP2レベルの蓄積および持続性の両方と一致している。脊椎膜のサブドメインの詳細な分析。

我々の阻害剤研究により、最初の LTD 誘導中の急速な PIP2 増加はほぼ独占的に PI4P によって引き起こされることが示されました。これと一致して、PIP5Kγ はシナプスにおける PIP2 の合成に主に関与していると考えられています 64。興味深いことに、脱リン酸化された PIP5Kγ661 はエンドサイトーシスアダプター複合体 AP265,66 と会合し、キナーゼ死んだ PIP5Kγ661 変異体または AP2 複合体と会合できない変異体を発現するニューロンは、LFS20 後に LTD を示さなかった。

LTD誘導中の樹状突起スパインにおけるPIP2シグナルの第2段階は、PIP2レベルのさらなる、しかし急速ではない増加によって特徴づけられ、特にスパイン頭部の上部および中部の細胞膜領域に限定されていた。ここでも、UNC3230 による PIP5K 阻害により、この期間の PIP2 動態が無効になりました。さらに、bpV(HOpic)を使用したPTEN阻害によって実証されるように、PIP3からのPIP2生成は、この期のPIP2レベルの上昇に寄与した。この発見は、NMDA インキュベーション後に PSD に PTEN が蓄積し、bpV(HOpic) による PTEN の阻害により海馬ニューロンの LTD が消失したという観察と一致しています 17。対照的に、PIP2 ダイナミクスの第 1 段階は PTEN 阻害の影響を受けませんでした。これらの結果は、LTD 誘導中に樹状突起スパイン頭部で観察される PIP2 レベルの増加の二相性の性質を明らかに強調しています。

一時的な信号イベントは適時に終了する必要があります。これは、NMDA による LTD 誘導の約 10 分後に始まる PIP2 ダイナミクスの第 3 段階の主要な側面です。樹状突起スパインにおける定常状態の PIP2 レベルは、約 30 分後に観察可能になりました。 PIP2 プローブとして過剰発現 PLC-PH を使用するのとは対照的に、分析に適用した PIP2 の直接抗体ベースの検出は、IP3 の増加による PIP2 からの解離の影響を受けないことに注意することが重要です。したがって、観察された標識密度の低下は、まさに樹状突起スパインの原形質膜における PIP2 の低下を反映しています。脊椎基部の原形質膜領域および周囲の樹状突起における PIP2 レベルがわずかに上昇する傾向は、PIP2 が豊富な脊椎頭部膜領域からの PIP2 拡散の寄与を示唆している可能性がありますが、観察された低下は明らかに、脊椎の活発な分解によって引き起こされました。 U-73122によるPLC阻害によって実証されるように、PLCによるPIP2シグナル。 LTD における PLC の重要性と一致して、U-73122 の適用は LTD67 を損なうと説明されています。

後の段階で観察されたPIP2レベルの低下はアクチン細胞骨格の変化に関連しており、それが最終的にLTDで観察される樹状突起スパインヘッドの縮小につながると考えられるようです。 PIP2は、例えばコフィリン68およびゲルゾリン69のF-アクチン切断活性を阻害するため、必要なアクチン再構成に対抗し、アクチンフィラメントを安定化させる可能性がある。さらに、PIP2 は、アクチン細胞骨格を原形質膜に結合することでスパインの収縮に対抗する可能性があります 70、71、72、73。一時的に上昇した PIP2 レベルが、LTD 誘導の 30 分後に樹状突起脊椎頭部膜の定常状態レベルに達したという我々の観察は、海馬スライスの低周波刺激後、脊椎頭部の体積と直径が減少する可能性があるという観察と時間的に非常によく一致しています。刺激後 15 ～ 60 分で観察されます 74。

まとめると、この研究は、LTD誘導中のPIP2の超高解像度ビューを提供し、樹状脊椎膜のサブドメインにおけるLTD誘導中のPIP2シグナルの基礎となる空間的および時間的原理と分子機構、およびLTD誘導中のその適時停止を解明する。

リポソームは基本的に Reeves と Dowben75 に従って調製されました。詳細には、クロロホルムおよびメタノール中の脂質の混合物（９８：２（ｖ／ｖ））をフェルンバッハフラスコの底に薄く広げた。混合物は、それぞれ 65% (w/v) ホスファチジルエタノールアミン (PE)、30% (w/v) ホスファチジルコリン (PC)、および 5% (w/v) の PIP2、PIP3、PI(3,4)P2 および PS から構成されていました。。脂質を窒素ガスの定常流下で 30 ～ 60 分間乾燥させ、残留溶媒をデシケーター内で 1 時間インキュベートして除去しました。次に、水飽和窒素流で脂質を 30 ～ 60 分間再水和した後、ddH2O 中の 0.3 M スクロース 5 ml を加えて、37 °C で 14 時間、さらに水和させてフラスコからリポソームを分離しました。次に、リポソームを含む懸濁液を 200,000 × g、28 °C で 1 時間遠心分離しました。リポソームを含むペレットを、最終脂質濃度が８ｍｇ／ｍｌとなるように、ｄｄＨ２Ｏ中の０．３Ｍスクロース２０μｌに再懸濁した。

生物学的材料を取得するために使用されたラット (Crl:WI; Charles River) は、動物実験に関する EU ガイドライン (ドイツ、バートランゲンザルツァの Thüringer Landesamt によって承認) に厳密に従ってイエナ大学病院の動物施設で飼育されました。初代細胞のみが死後の妊娠ラットから調製されたため、この研究には動物実験の許可は必要ありませんでした。初代海馬ニューロンの調製に使用した胚は E18 で、性別は不明です。

NIH3T3 細胞は標準条件下で維持および培養されました。

ラット (Crl:WI; Charles River) の初代海馬ニューロンは、主に Banker と Cowan 76 によって開発され、以前に確立された原理に従って調製および培養されました 23。詳細には、E18 ラットの脳を氷冷 HBSS (Invitrogen) 中で解剖しました。次いで、単離した海馬を、0.05% トリプシン/EDTA (Invitrogen) を用いて 37 °C で 15 分間トリプシン処理しました。上清を Neurobasal 培地 (Invitrogen) と交換し、B-27 サプリメント (Invitrogen) および 0.5 mM L-グルタミン酸を補充しました。次いで、１ｍｌのパスツールピペットを用いて注意深く粉砕することにより、組織を単一細胞に解離させた。

凍結割砕の準備として、ニューロンはサファイアディスクを備えた 24 ウェルプレートで培養する必要がありました (Rudolf Brügger、Swiss Micro Technology)22,23。準備として、サファイアディスクを慎重に洗浄および洗浄し、37 °C で一晩ポリ-D-リジンでコーティングしました。ポリ-D-リジンを吸引し、ddH2Oで10分間3回洗浄することにより注意深く除去した。次に、サファイアディスクを乾燥させ、紫外線を 15 分間照射しました。

初代ニューロンを、準備したサファイアディスクを補充した 24 ウェルプレートに、ウェルあたり 80,000 細胞の密度で播種しました。次に、初代海馬ニューロンを、2 mM L-グルタミン、1× B27、およびペニシリン/ストレプトマイシン (ml あたりそれぞれ 100 U および 100 μg) を含む NeurobasalTM 培地で約 2 週間培養しました (37 °C、湿度 90%)。および 5% CO2)。サファイア上の DIV14 ～ 16 では、ニューロンがシナプスとニューロンネットワークを形成しており 22、実験に使用されました。

LTD は NMDA で誘導されました 26,31。詳細には、海馬ニューロンを2μM TTXでのプレインキュベーション（60分間）によってシナプス前に沈黙させた後、50μM NMDAでLTDを最大3分間誘導し、その後、分析の異なる時点で前調整培地で追跡しました。

LTD誘導中に一時的にPIP2を提供し、その後の時点でPIP2レベルの低下につながる経路を調査するために、NMDA処理前に阻害剤またはそれらに対応する溶媒対照を添加した。最終濃度およびプレインキュベーション時間は以下の通りであった：ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ｄｄＨ２Ｏ中で１５ｎＭ、６０分間。 U-73122、0.2% (v/v) DMSO 中で 10 μM 60 分間。 0.002% (v/v) DMSO 中で 500 nM の UNC3230 を 16 時間。

銅プロファイル (高さ 0.6 mm) を凍結割断に使用しました。使用前に、プロファイルを 4% (w/v) 酒石酸を含む超音波処理槽で洗浄し、純アセトンで洗浄し、純メタノールで保存しました。

リポソームの凍結破砕では、サンドイッチダブルレプリカ技術 77 を使用して、2 μl のリポソーム溶液を 2 つの銅プロファイル間に分配しました。サンドイッチは、液体窒素で冷却された液体プロパン/エタン (1:1) 中で直ちにプランジ冷凍されました (冷却速度 > 4000 K/s)78。

3 つのサンドイッチを、同様に液体窒素で冷却した二重レプリカ標本テーブルに置きました。次に、サンプルを -140 °C に冷却した BAF400T 凍結破砕機 (Leica) に移しました。真空が確立され、圧力が 10-6 mbar 以下になった後、テーブルをひっくり返して開き、間にサンプルを挟んだ 2 つの挟まれたプロファイルが分離され、サンプルが凍結割断されました。すぐに、15 ～ 20 nm のカーボンコートが 90 度の角度でサンプル上に蒸着され、続いて 35 度の角度で約 2 nm の白金/カーボンコートが蒸着されました 78。サンプルを凍結破砕機から抽出し、解凍し、2.5% (w/v) SDS 上に浮かべ、穏やかに振盪しながら室温で一晩インキュベートしました。

PBS で 10 分間洗浄を 3 回行った後、1% (w/v) BSA、0.5% (w/v) 魚ゼラチン、0.005% (v/v) Tween® 20 を含む PBS (pH) 中でインキュベートすることにより、非特異的結合をブロックしました。 7.2) (LBB) 室温で 30 分間。次いで、レプリカをマウスモノクローナル抗PIP2抗体(Enzo Life Sciences)とともにLBB(標準条件、1:100、すなわち10μg/ml)中で4℃で一晩インキュベートした。未結合の一次抗体を、LBBで3回(各10分)洗浄することによって除去した。次にサンプルを、LBB (RT) (5、10、および 15 nm 金、BBI Solutions) で希釈した金粒子結合ヤギ抗マウス二次抗体中で 2 時間インキュベートしました。未結合の二次抗体を PBS で洗浄 (3 × 10 分) して除去しました。次いで、免疫標識レプリカをＰＢＳ中の０．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドで１０分間固定し、ｄｄＨ２Ｏで１０分間２回洗浄し、コーティングされていない銅グリッド上に載せて乾燥させた。

NIH3T3 細胞 77,78 の凍結破砕では、細胞の懸濁液をリポソームの分析について上記したのと同様の 2 つの銅プロファイルの間に置き、その後、上記のように凍結破砕して免疫標識しました。

ニューロンの凍結割断実験 22、23、24 では、ニューロンをポリ D リジンでコーティングしたサファイアディスク上で成長させました (上記を参照)。サファイアディスクは、二重レプリカ標本テーブルに収まるように、高さ 0.8 mm の銅プロファイル上に配置されました。凍結アーチファクトを避けるために、20% (w/v) BSA の液滴をサンドイッチ部分の間に追加しました。次いで、凍結破砕および免疫標識を上記のように行った。

レプリカは、80 keV で操作される EM902A 透過型電子顕微鏡 (Zeiss) で検査されました。

イメージングは、1 k FastScan CCD カメラ (TVIPS カメラおよびソフトウェア) を使用して行われました。画像はEM-Menu 4ソフトウェア（TVIPS）を使用してデジタル化されました22、23、24。

抗 PIP2 抗体による膜内の PIP2 の検出可能性は、PIP2 含有リポソームを使用して最初に検討されました。 PIP2 の代わりに、それぞれ PIP3、PI(3,4)P2、および PS を含むリポソームを対照として調べました。画像は、ランダム化サンプリングによって、つまり、PIP2標識に関係なく、ゼロプロファイルを含めて撮影されました。 NIH3T3 細胞膜のイメージングにも同じことが当てはまります。

ニューロンの凍結割断膜を用いた抗 PIP2 免疫標識特異性の決定は、DIV14 ～ 16 のラット海馬ニューロンを使用し、グリッド全体で系統的にサンプリングして行われました。 3 つのカテゴリーすべて (コントロールとしての氷と E 面、P 面) の面積を測定し、面積あたりの金粒子の量を数え、標識密度 (μm2 あたりの粒子として決定) を比較して、抗体の特異性をテストしました。

二次抗体対照および凍結破砕サンプル（PIP2を添加したリポソームと抗体をプレインキュベートすることによって一次抗体結合が消光されたもの）は、追加の対照として機能しました。

抗 PIP2 抗体の異なる希釈 (5、10、および 20 μg/ml の濃度に相当する 1:200、1:100、1:50) を用いた追加の定量実験を使用して、飽和 PIP2 検出をもたらす抗体希釈を確立しました。

TEM による視覚化の前に、サンプルは同僚によって盲検化されました。記録された画像のブラインド化は、Ant Renamer ソフトウェア (antp.be/software/renamer) を使用して行われました。 TEM 画像は、グリッドを系統的にスクリーニングすることによって取得されました。

細胞体および樹状突起の凍結割断された原形質膜領域の画像を体系的に記録し、画像を盲検化し（上記参照）、それぞれの領域（E 面、P 面、氷）を決定し、抗-PIP2標識密度を測定した。マッシュルームスパインとして明確に分類できるすべての形態学的構造と、スパインで装飾されていない隣接する樹状突起セグメントを分析に使用しました。つまり、長さが 0.75 μm 未満で 2 μm を超える樹状突起スパインを含む画像と、長さが 2 μm を超えるスパインの画像のみを使用しました。目に見える樹状突起の付着物はすべて廃棄されました。

脊椎は基部、頸部、脊椎頭部に細分されました。一部の分析では、頭部の長さを同じ高さの 3 つの部分に分割することで、脊椎の頭部をさらに 3 つの部分に分割し、上部、中部、下部の頭部を作成しました。エリア定義の手順は次のとおりです。まず、ベースを定義します。スパインに隣接する樹状膜の点を相互接続する接地線を引いた。接地線に隣接する同じ長さのさらに 2 本の平行線を 150 nm の距離で描き、次に接続しました (90° の角度)。含まれる細胞領域はベース領域として定義されました (図 2 も参照)。地面の線の半分を表す位置から、脊椎の先端まで別の線が引かれ、脊椎の縦軸が定義されました。脊椎の縦軸から長方形に、90°の角度で線を引いて、首を頭部から分離しました (図 2)。この境界は通常、首の 2D の広がりとプラチナシャドウイングによって提供される 3D 情報によって容易に認識できます (図 2)。頭部領域は、長手軸によって定義される頭部の長さの 3 分の 1 と 3 分の 2 を反映する位置に描かれた、長手軸に対して直交する 2 本の線によって、さらに 3 つの領域 (頭部下部、頭部中央、頭部上部) に分割されました (図 4a)。。次に、ImageJ/FIJI のポリゴン選択ツールを使用して、事前定義された境界線と膜プロファイルに従ってすべての領域を囲み、ImageJ を使用して測定しました。

各領域内の抗 PIP2 免疫金標識を計数し、ImageJ/FIJI を使用して、各細分割および分析された脊椎に対応する追加の樹状膜領域の標識密度を決定しました。ラベルが描かれた境界線または分離線に直接配置されている場合、ラベルは金粒子で覆われた領域のより広い範囲に割り当てられました。高い値とゼロプロファイルを含む、得られたすべてのデータが考慮されました。生物学的差異は決定された標識密度の全範囲に反映されるため、「外れ値」分析は行われず、データ収集から「外れ値」も除去されませんでした。

脊椎における PIP2 シグナルの時間分解解析および阻害剤研究では、すべての結果を定常状態条件 (0 分) の脊椎全体で検出された平均標識密度に正規化しました。

直径 100 nm の円形 ROI を使用してクラスター分析を実行しました。以前に確立された手順に従って、22、23、24、77 個のクラスターが ROI あたり n ≥ 3 個の金粒子として定義されました。

統計分析はGraphPad Prismを使用して実施されました。シャピロウィルクテストを使用してデータが正規分布していた場合は、スチューデントの t 検定 (2 つの条件の比較)、または一元配置分散分析 (一元配置 ANOVA) とその後のテューキーの多重比較検定 ( 2 つ以上の条件の比較) を実行しました。

Shapiro-Wilk 検定が非正規分布を示唆した場合は、Mann-Whitney 検定 (2 条件の場合) または Kruskal-Wallis 検定 (3 条件以上) とその後の Dunn の多重比較検定が使用されました。

2 因子分析の場合、二元配置分散分析は、その後のシダックまたはボンフェローニの多重比較検定と組み合わせて実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

著者らは、この研究の結果を裏付けるすべてのデータが論文およびその補足情報ファイル内で入手可能であることを宣言します。定量分析の基礎となるすべての個々のデータポイントを報告するソースデータについては、補足データ 1 を参照してください。

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技術サポートをしていただいた K. Gluth、A. Kreusch、S. Linde、M. Roeder に感謝します。この研究は IZKF と DFG (RTG1715 SP19 および KE685/7-1 から MMK へ、および QU116/9-1 から BQ へ) によってサポートされました。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。

イエナ大学病院生化学研究所 I — フリードリヒ・シラー大学イエナ、07743、イエナ、ドイツ

サラ・A・ホフブラッカー＝マッケンジー、エリック・シーマン、ブリッタ・クアルマン、マイケル・M・ケッセルズ

イエナ大学病院電子顕微鏡センター — フリードリヒ・シラー大学イエナ、07743、イエナ、ドイツ

マーティン・ウェスターマン

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SAH-M. ES は実験を設計、実行し、データを解釈しました。 SAH-M. 原稿の一部を共同執筆した。 MW は技術的なアドバイスを提供し、電子顕微鏡技術と機器へのアクセスを提供しました。 SAH-M.、ES、MMK の可視化データ。 MMKは要求された確認のための独立した検査を実施した。 BQ と MMK はプロジェクトを発案し、実験を計画し、データを解釈し、原稿を書きました。

Britta Qualmann または Michael M. Kessels との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読への貢献について、Zachary T. Graber 氏と深沢祐悟氏に感謝します。主な取り扱い編集者: Joao Valente。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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Hofbrucker-MacKenzie, SA、Seemann, E.、Westermann, M. 他ニューロンの長期抑制には、PIP5K、PTEN、および PLC に依存するホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸の時間的および超微細構造の動態が関与します。 Commun Biol 6、366 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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受信日: 2022 年 6 月 21 日

受理日: 2023 年 3 月 17 日

公開日: 2023 年 4 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04726-0

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