ωRNAおよび標的DNAと複合体を形成したOMEGAニッカーゼIsrBの構造

Aug 07, 2023

Nature volume 610、pages 575–581 (2022)この記事を引用

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CRISPR-Cas などの RNA 誘導システムは、プログラム可能な基質認識と酵素機能を組み合わせており、この組み合わせは強力な分子技術の開発に有利に使用されています 1,2。これらのシステムの構造研究により、RNA とタンパク質がどのように共同して基質を認識して切断するのかが解明され、さらなる技術開発のための合理的な工学の指針となりました 3。最近の研究により、OMEGA と呼ばれる新しいクラスの RNA 誘導システムが同定されました。これには、Cas9 の祖先と考えられる IscB と、HNH ヌクレアーゼドメインを欠く IscB のホモログであるニッカーゼ IsrB が含まれます。 IsrB はわずか約 350 個のアミノ酸で構成されていますが、その小さいサイズは、比較的大きな RNA ガイド (約 300 nt の ωRNA) によってバランスがとれています。今回我々は、同族のωRNAおよび標的DNAと複合体を形成したDesulfovirgula Thermocuniculi IsrB（DtIsrB）の極低温電子顕微鏡構造を報告する。 IsrB タンパク質の全体構造が Cas9 と共通の足場を共有していることがわかりました。しかし、標的選択を促進するために認識（REC）ローブを使用するCas9とは対照的に、IsrBはωRNAに依存しており、その一部はRECと同様に位置する複雑な三重構造を形成します。 IsrB とその ωRNA の構造解析、および他の RNA 誘導システムとの比較により、タンパク質と RNA 間の機能的相互作用が明らかになり、これらの多様なシステムの生物学と進化についての理解が深まります。

RNA 誘導性 IsrB タンパク質は、トランスポゾンの IS200/IS605 スーパーファミリーにコードされる OMEGA ファミリーのメンバーです。 IsrB は、Cas9 の明らかな祖先であるもう 1 つの OMEGA ファミリーメンバーである IscB の先祖であると考えられます。これは、系統解析と共有された独自のドメイン構造の両方によって示されています 4,5。 IscBおよびCas9と同様に、IsrBにはブリッジヘリックス（BH）の挿入によって中断されるRuvC様ヌクレアーゼドメインが含まれています（図1a）。ただし、IscB および Cas9 とは対照的に、IsrB は HNH ヌクレアーゼドメイン、REC ローブ、およびプロトスペーサー隣接モチーフ (PAM) 相互作用ドメインの大部分を欠いており、したがって Cas9 よりもはるかに小さい (約 350 アミノ酸) 。 IsrBにはさらに、N末端PLMPドメイン（保存されたアミノ酸モチーフにちなんで命名）と特徴づけられていないC末端ドメインが含まれています（図1b）。これまでの研究では、IsrB が約 300 nt の ωRNA と会合し、これにより IsrB が 5'-NTGA-3' 標的隣接モチーフ (TAM) を含む二本鎖 (ds) DNA の非標的鎖にニックを入れるよう誘導されることが示されています4。。

a、IsrB (左) および Cas9 (右) の遺伝子座構造とガイド RNA。 b、化膿連鎖球菌 SpCas9 (上) および D. サーモクニクリ IsrB (DtIsrB) (下) のドメイン構造。 c、ωRNAおよび標的DNAと複合体を形成したIsrBの概略図。 TAMを含む部分DNA二本鎖と構造研究に使用した標的配列を配列文字で示します。 d、e、IsrB-ωRNA-ターゲットDNA複合体のクライオEM密度マップ（d）および構造モデル（e）。破線は、ωRNA のあまり分解されていない領域を表します。 TE、トランスポゾン末端。 DR、ダイレクトリピート。 NUC、ヌクレアーゼ。 PI、PAM 相互作用。 PLL、リン酸ロックループ。 TI、TAM との相互作用。 TS、ターゲット鎖。 NTS、非ターゲット鎖。

IsrBによるωRNA誘導DNAターゲティングの分子機構を特徴付けるために、我々は、20ntのガイドセグメント、31ntの標的DNA鎖、および10ntのガイドセグメントを含む284ntのωRNAであるDesulfovirgula Thermocuniculi IsrB（DtIsrB）を含む三元複合体を分析した。 -nt 単一粒子クライオ EM を使用した非ターゲット DNA 鎖 (図 1c)。全体の解像度 3.1 Å で三元複合体の 3 次元（3D）再構成が得られました（図 1d、拡張データ図 1a ～ c、および拡張データ表 1）。ただし、ωRNA に対応するマップの一部の領域は、より低い解像度で分解されました。 RNA 座標のモデリングを改良するために、RNA 固有のモデリングツールである auto-DRRAFTER を共分散ベースの二次構造モデルとともに使用して、初期の ωRNA モデルを構築しました。このωRNAモデルとタンパク質構造予測によって生成された初期IsrBモデルに基づいて、IsrB-ωRNA-DNA構造を決定しました（図1eおよび拡張データ図1d、e、2）6、7、8。

この構造により、IsrBがωRNAと標的DNAの間の20塩基二重鎖を介して標的DNAに広範囲に結合することが明らかになりました（図1e）。 RuvC ドメイン (残基 60 ～ 253) には、3 つの触媒モチーフ (RuvC I ～ III) と 3 つの挿入 (BH (残基 92 ～ 112)、A (残基 113 ～ 129)、および B (残基 161 ～ 179)) が含まれます (図.1b)。挿入 A は、BH と RuvC II の間の「ショートカット」リンカーです。このリンカーは Cas9 の REC ローブに置き換えられます。したがって、この挿入を REC リンカー (RECL) と呼びます。 RuvC II と III の間の挿入 B は、ループと α ヘリックスからなる単純なリンカーであり、IsrB 構造では Cas9 の HNH ドメインの位置に対応する位置を占めます。したがって、これをHNHリンカー(HNHL)と呼びます。 C末端ドメイン（残基287〜351）は、2つの歪んだβシート（β1/2/6およびβ3/4/5）を含むコアフォールドを採用し、TAM含有DNA二本鎖に結合します（図1eおよび拡張データ図） .3a)。 Cas9のPAM相互作用ドメインと構造的および機能的に類似しているため、このドメインをTAM相互作用（TI）ドメインと呼びます（拡張データ図3b）。余分なβ鎖（β7）は、TIドメインのコアフォールドと広範囲に相互作用し、RNaseHフォールドを採用するRuvCコアと共通のβシートを共有します（拡張データ図3a）。この配置は、TIドメインとRuvCドメインが協力してRuvC活性部位とTAM結合部位の間の距離を定義することを示唆しています（図1e）。 RuvC ドメインと TI ドメインの間の中間領域 A (残基 254 ～ 267) と B (268 ～ 286) は、それぞれ Cas9 のリン酸ロックループと WED ドメインに機能的に類似していると思われるため、これらの用語を IsrB に採用しました。 (図1e)。 PLMPドメイン（残基1〜59）は、4本鎖の逆平行βシート（β1〜4）とαヘリックスを特徴とし、翻訳開始因子3のN末端ドメインと構造的に類似しています（図1eおよび拡張データ）図3aおよび4)。このドメインでは、PLMP モチーフを含む鎖 (β2) は 2 つのプロリン (Pro17 および Pro20) が水素結合の 1 つを破壊するために膨らんでいますが、凝集した鎖 (β1) の完全性は保たれているようです。 PLMP ドメインは RuvC ドメインおよび TI ドメインと広範囲に相互作用しており、それらの機能をサポートする役割があることが示唆されています。

ωRNA は、標的 DNA と塩基対を形成する 20 nt のガイドセグメントと、262 nt の ωRNA 足場から構成されます。この足場は 12 個のヘリックス (4 つのステム (S1 ～ 4) と 8 つのステムループ (SL1 ～ 8)) で構成され、これらは 3 つの層 (層 1、S1/3 および SL1/2/5/6、層 2、 S2/4 および SL3/4、layer3、SL7/8) (図 2a、b)。すべての RNA ヘリックスは、さまざまな RNA 相互作用によって一緒に詰め込まれます。 S1-SL1、S2-SL3、および S3-SL6 の組み合わせは、各組み合わせで直接スタックされます。 S4 と SL4 は、A152 と U154 間の直接スタックと、A152、U179、および U183 間のベーストリプル構成により、同軸にスタックされます。 SL2とSL5は擬似ノット（アダプター擬似ノットと呼ぶ）を形成し、G81、A192、U197によって形成されるベーストリプルで覆われています（図2c）。一部の RNA ヘリックスは、球状の ωRNA 構造内の層を接続します。 S2、C107、A108、G245およびA246はネクサス領域を形成し、これはCas9のtracrRNAに広く保存されています（参考文献9）（図2a）。このネクサス領域と S4 は、レイヤー 1 と 2 の間で、それぞれ S1 と SL5 に直接接続されています。 SL4 は、S2 と SL7 の間の領域と擬似ノット (これをネクサス擬似ノットと呼びます) を形成し、レイヤー 2 と 3 の間の相互作用を可能にします (図2a、b)。シュードノットの塩基対を破壊する変異によりDNAニッキング活性が消失し、その後アダプターシュードノットの塩基対を回復する変異によりこの活性が部分的に回復し、ωRNA機能におけるシュードノットの重要性が強調されました（図2d）。これらの構造および生化学データは、ωRNA がさまざまな RNA 相互作用によって達成されるコンパクトな球状構造を形成していることを示しています。このような構造は、OMEGA システムにとって有益である可能性があります。ωRNA が自律的に球状構造を形成し、足場として機能する場合 (tracrRNA とは対照的に)、エフェクタータンパク質は RNA のフォールディングと機能をサポートするための補助モチーフ/ドメインを必要としません。さらに、球状の形状が内因性 RNA 分解に対してある程度の耐性を提供する場合、エフェクタータンパク質とトランスで機能する ωRNA を促進する可能性があります。この後者の可能性は、関連する OMEGA エフェクター IscB4 とともに機能できるスタンドアロンの ωRNA の発見によって裏付けられています。

a、b、ωRNA足場（残基21～282）の概略図（a）および構造モデル（b）。 S1 ～ 4、ステム 1 ～ 4。 SL1 ～ 8、ステムループ 1 ～ 8。 PK、仮結び。 aでは、標準塩基対と非標準塩基対が黒い実線で示されています。解像度が低い領域は破線のボックスで囲まれています。 b では、わかりやすくするためにガイドセグメントが省略されています。 c、アダプター擬似ノットのベーストリプル形成。水素結合は破線で示されています。 d、完全長ωRNAまたは切断型ωRNAを用いたdsDNA基質(TTGA TAMによる)のインビトロ再構成DtIsrB-ωRNA RNPニッキング。 n = 3 つの独立した技術的複製。 Δ34-67、ヌクレオチド 34-67 が GAAA に置換された ωRNA。 165-AGCG-168、ヌクレオチド 165 ～ 168 が AGCG に置換された ωRNA。 194-GCGG-197、ヌクレオチド 194 ～ 197 が GCGG に置換された ωRNA。 194-GCGG-197/81-CCGC-84、ヌクレオチド 81 ～ 84 および 194 ～ 197 がそれぞれ CCGC および GCGG に置換された ωRNA。

ωRNA の 5' ステム領域 (S1、SL1、および SL2) はガイドアダプター領域と呼ばれます。 OMEGA システムから CRISPR-Cas への進化の移行中に、ωRNA の SL2 および S1/SL1 の下降鎖が CRISPR アレイを形成するように適応され、機能的な Cas9-CRISPR RNA (crRNA)-tracrRNA の形成を可能にしたと考えられます。複合体です（図1a）。ガイドアダプター領域をコードするゲノム配列は、細菌ゲノムにおける IS200/IS605 トランスポゾン活性にとって重要です 10 (図 2a)。我々はこの領域の一部であるSL1（ΔSL1 ωRNA）を切断し、得られたRNAが依然としてIsrBによる強力なDNAニッキング活性をサポートしていることを発見しました（図2d）。さらに、ΔSL1 ωRNAをIsrBタンパク質と標的DNAで再構成し、単一粒子分析を実行して、6.9Åの分解能マップを生成しました（拡張データ図6a〜e）。このマップを完全長RNAのマップと比較すると、RNAモデルから決定されたSL1の位置が検証され、完全長RNAとΔSL1 RNAの間の構造の類似性が明らかになりました（拡張データ図6a、b）。これらの結果は、ガイドアダプター領域の SL1 が IsrB による標的 DNA ニッキングに必要ではなく、代わりに IsrB をコードするトランスポゾンの移動性に関与する他の機能に寄与している可能性があることを示しています。 ωRNA足場は、HNHL領域を除くIsrBのすべての部分と広範囲に相互作用します（図1e）。特に、PLMPドメインは、ωRNAの3'末端近くのタンデムヘアピン(SL7およびSL8)と相互作用します。 SL7/8の切断はIsrBのニッキング活性を減少させたが、SL8は減少させなかった(図2d)。 ωRNA の末端ヘアピン (SL7) に IsrB コード領域のすぐ上流に位置する Shine-Dalgarno 配列が含まれていることを考えると、これらの結果は、IsrB と ωRNA の相互作用が IsrB の機能にとって重要であり、IsrB 発現の制御に寄与している可能性があることを示しています。ネイティブのコンテキストで。

次に、構造情報を活用して、IsrB の DNA ターゲティング機構を解読しようとしました。 gRNA-標的DNAヘテロ二本鎖は、ωRNAのS2/S3/S4/SL2/SL4/SL5、RuvCドメインおよびIsrBのBH/RECL/HNHL領域に囲まれています（図1eおよび2b）。 SL2、SL4、およびSL5は、水素結合とファンデルワールス相互作用を通じてヘテロ二重鎖骨格に直接接触します（図3a、b）。 S2、S3、およびS4は、短いペプチドリンカーRECLを使用してヘテロ二本鎖骨格を間接的に認識します。RECLでは、残基113〜124がS2/S3/S4およびヘテロ二本鎖の溝に適合するように誘導されます（図3b）。 F119およびR124をアラニンに変異させると、IsrBのDNAニッキング活性が低下し、RECLにおけるこれらの残基の機能的重要性が強調されました（図3c）。 ωRNAに加えて、IsrBタンパク質はヘテロ二本鎖に広範囲に結合します（図1e）。 HNHLは、骨格リボース部分との相互作用を通じてヘテロ二本鎖の副溝を認識します（図3d）。我々は、HNHLの残基V161〜F174を欠失させることによってこの相互作用の重要性を確認し、これによりDNAニッキング活性が消失した（図3cおよび拡張データ図5b）。 BH のいくつかのアルギニン残基は、Cas9 ガイド RNA 複合体と同様の方法で ωRNA ガイドセグメントのリン酸骨格に接触しており、ガイド RNA と BH の相互作用は、DNA 認識と巻き戻しのためにガイド領域を事前に制御します 12（図 3f）。）。 R100ではなくR104をアラニンに変異させると、IsrBのDNAニッキング活性が低下し、BHにおけるR104の機能的重要性が強調された（図3c）。標的領域 (dG1 ～ dC20) の下流では、ωRNA 相補 DNA 鎖 (つまり、標的鎖) が反転し、非標的 DNA 鎖と塩基対合して、TAM 含有二重鎖 (dA[-1]) を形成します。 -dA[−10]–dT1*-dT10*) (図1c、e)。標的鎖のdC20とdA（-1）の間の主鎖リン酸基は、リン酸ロックループのAsn265によって認識され、それによってヘテロ二重鎖の形成が促進されます（図3e）。 N265をアラニンに変異させるとニッキング活性が低下し、この残基がDNAの巻き戻しに重要であることが示唆された（図3c）。 PLMPドメインとTIドメインのβ7モチーフは、RuvC-TI-PLMP足場の重要なユニットです（拡張データ図3a）。これらのドメイン/モチーフを切断すると、IsrBのDNAニッキング活性が消失し、RuvC-TI-PLMPの硬い足場の重要性が示されました（図3cおよび拡張データ図5b）。これらの発見は、IsrB と ωRNA 足場の両方が、DNA ターゲティングにおけるガイドとターゲットのヘテロ二本鎖の認識に実質的に寄与していることを示しています。

挿入図は、拡大されたパネルの位置を示します。 a、アダプター擬似ノットによるヘテロ二本鎖認識。 b、SL4、S4およびRECLによるヘテロ二本鎖認識。 RNA および DNA の量は、キメラ X を使用して原子座標から生成されます。c、野生型 (WT) または変異体 DtIsrB を使用した dsDNA 基質 (TTGA TAM を使用) のインビトロ再構成 DtIsrB-ωRNA RNP ニッキング。 n = 3 つの独立した技術的複製。 ΔHNHL、残基 161 ～ 174 が GSG リンカーで置換された IsrB 変異体。 Δβ7、残基 341 ～ 353 が欠失した IsrB 変異体。 ΔPLMP、残基 1 ～ 52 が欠失した IsrB 変異体。欠失変異体のタンパク質の安定性を確認するために、欠失変異体を過剰発現する細菌ライセートにおけるタンパク質発現をチェックしました（拡張データ図5b）。 d、HNHLによるヘテロ二本鎖認識。 e、リン酸ロックループによる+1リン酸（標的鎖DNAのヌクレオチドdG1とdA(-1)の間のホスホジエステル結合）の認識。 f、BHによるガイドセグメントの認識。 g、TI ドメインによる TAM 認識。 h、DtIsrBのTAM特異性。 WT または変異体 DtIsrB を使用した dsDNA 基質 (TTGA/ATGA/TTGG/ATGG TAM を使用) の in vitro 再構成 DtIsrB-ωRNA RNP ニッキング。 n = 3 つの独立した技術的複製。

我々は以前に、DtIsrB が NTGA TAM 優先性を示すことを発見しました 4 が、DtIsrB が好熱性酵素であることを考慮して、TAM 同定アッセイを 60 °C で繰り返しました。この温度では、TTGA TAM の優先度が観察されました (図 4b)。次に、この好みを構造的に特徴づけようとしました。 TAM含有二本鎖はWEDドメインとTIドメインの間の裂け目に結合しており、非標的鎖のTAM核酸塩基がTIドメインの残基によって読み取られます（図1eおよび3g）。 dT1* 核酸塩基はタンパク質と直接接触しませんが、dT2* 核酸塩基の C5 は、dT1* の C5 および Arg323 側鎖の脂肪族部分とファンデルワールス相互作用を形成します。これは、タンパク質の最初と 2 番目の T が優先されることと一致しています。タム。 dG3* の O6 および N7 は、TAM の 3 番目の G に対する優先性と一致して、R323 と相互作用します。 R323A 変異体には切断活性が欠如しており、TAM 認識における R323 の役割が裏付けられています (図 3c)。 dA4* の N6 および N7 は Gln326 と相互作用し、TAM の 4 番目の A が優先されることと一致しています。 Q326が4番目のTAMヌクレオチドを認識するかどうかをテストするために、この残基をアラニンに変異させたところ、この変異により標的の切断が無効になることがわかりました（図3c）。野生型 IsrB は、TTGA/ATGA TAM では標的に対して切断活性を示したが、TTGG/ATGG TAM では示さなかった（図 3h）。しかし、Q326R 変異体は、これら 4 つの TAM のすべてに対して活性を示しました。これらの結果は、Q326 が TAM の 4 番目のヌクレオチドを認識することを示しています。 SpCas9では、1,335位のアミノ酸（野生型SpCas9ではArg、SpCas9 VQR変異体ではGln）とPAMの3番目のヌクレオチド（GまたはA、それぞれ）13、14。同様に、IsrB では、TAM の 326 位のアミノ酸と 4 番目のヌクレオチドの間の水素結合相互作用を変更することで、TAM の優先度を変更できます。まとめると、これらの結果は、DtIsrB が水素結合とファンデルワールス相互作用の組み合わせによって非標的鎖の TTGA TAM を認識することを示し、これらの相互作用を変えることで TAM の優先性が拡大する可能性があることを示しています。

a、選択された IsrB オーソログの系統樹。タンパク質のサイズが示されており、ドメインは色付きのボックスで強調表示され、保存された配列は黒で表示されます。同族RNAのサイズとグループ（図4d）が示されています。 b、ランダム化TAMおよび標的配列を含むプラスミドライブラリーのインビトロ切断を使用した6つのIsrBオルソログのTAM配列。 c、5つのIsrBオルソログによるdsDNA基質のインビトロ再構成IsrB-ωRNA RNPニッキング。 CwIsrB、CsIsrB、および K2IsrB の場合、ターゲット DNA には TTGA TAM が含まれていました。 DsIsrB および BbIsrB の場合、ターゲット DNA には ATGG TAM が含まれていました。 n = 3 つの独立した技術的複製。 d、二次構造予測に基づく6つのIsrBオルソログのωRNA足場の構造モデル。予測される ωRNA 足場は、グループ A (サブグループ A1、CsIsrB および K2IsrB、サブグループ A2、BbIsrB) と B (サブグループ B1、DtIsrB、サブグループ B2、CwIsrB および DsIsrB) に分類されます。グループ A では、SL2 と SL4 が擬ノットを形成し、SL5 と S2 と SL7 の間の中間領域が擬ノットを形成します。グループ B とは異なる接続領域はピンク色で表示されます。 SL5 と S3 の間の中間領域、および SL7 の後の末端領域 (「モチーフなし」、灰色) は、不対ヌクレオチドであると予測されます。グループ B では、SL2 と SL5 が擬似ノットを形成し、SL4 と S2 と SL7 の間の中間領域が擬似ノットを形成します。接続領域 (赤色) はグループ A と同じです。SL5 と S3 の間の中間領域および SL7 の後の末端領域はステムループ (SL6 と SL8、灰色) であると予測されます。サブグループ A1 と B1 では、S2 と S3 の間の中間領域はステムループ (SL3、濃い灰色) であると予測されますが、サブグループ A2 と B2 では、その領域は不対ヌクレオチド (「モチーフなし」、濃い灰色) であると予測されます。）。

IsrB の DNA ニック形成機構を調べるために、サンガー配列決定により DNA 内のニック形成部位を特定しました。 PAM15の2〜5nt上流の非標的鎖を切断するCas9とは対照的に、IsrBはTAMの8〜11nt上流の非標的鎖にニックを入れました（拡張データ図6a）。ニックの入った産物を模倣するために、SL1 切断型 IsrB 複合体構造の非標的鎖の 5' 末端に 10 nt を追加しました (拡張データ図 6b)。 RuvCドメインにドッキングされている非標的鎖の伸長部分のEM密度を観察しました（拡張データ図6e）。 IsrB 構造では、非標的鎖の TAM および TAM 近位部分が RuvC ドメインから除去されます (拡張データ図 6e、f)。一方、SpCas9 構造では、非標的鎖の PAM 近位部分が除去されます。鎖は、RuvC ドメインおよび HNH ドメインと相互作用します 16 (拡張データ図 6g)。 RuvC ドメインにロードされた非標的鎖間の立体構造の違いは、SpCas9 によって作られた DNA 切断と比較して、IsrB によって作られた DNA 切断の異なる位置を説明します。

IsrB にわたる ωRNA 三元構造の保存を評価するために、5 つのオルソログ (CwIsrB、Crocosphaera watsonii の IsrB、Dolichospermum sp. の DsIsrB、IsrB、Calditerricola setsumensis の CsIsrB、IsrB、Burkholderiales 細菌の BbIsrB、IsrB、K2IsrB、Is) を同定しました。 rBが発見されましたウイルスメタゲノムアセンブリのコンティグk249_576930から）およびそれらの同族ωRNA（図4a）。 TAM発見アッセイは、CwIsrB/K2IsrB/CsIsrB/DsIsrBがNTG TAMを認識するのに対し、BbIsrBはNTGG TAMを認識することを示しました（図4b）。我々は、これらのωRNAの機能を確認し、単一のTAMを含む標的DNAを用いたDNA切断アッセイを使用してTAMの優先性を検証しました（図4c）。我々は、これらの IsrB オーソログの 3D 構造モデルと、それらの同族 ωRNA の共分散折り畳まれた 2 次元 (2D) 構造モデルを生成しました (拡張データ図 7)。タンパク質3DモデルとRNA 2Dモデルは、実験的に決定されたDtIsrBおよびその同族ωRNAの構造と互換性があり、構造予測の一般的な信頼性が実証されました（図2aおよび拡張データ図7a、b）。二次構造予測では、DtIsrBと他の5つのオルソログのωRNAは、4つのステム（S1〜4）と5つのステムループ（SL1/2/4/5/7）からなるコアドメイン構成を維持しています（図4dおよび拡張）データ図 7a)。 DtIsrB ωRNA（DtRNA）のクライオEM構造では、SL3、SL6、およびSL8は足場の周囲に位置し、コアの形成には寄与しません（図2b）。 SL8の切断はDtIsrB切断活性にそれほど影響を与えず、このモチーフを欠くωRNAが少なくともIsrBの最小限の機能をサポートしていることを示している（図2d）。 CwIsrBおよびDsIsrBのωRNAでは、SL2およびSL5、ならびにSL4およびSL7に隣接する一本鎖領域は、DtRNAの構造と一致して、2つのシュードノット構造を形成すると予測されます（図4dおよび拡張データ図7a）。。対照的に、CsIsrB、K2IsrB、およびBbIsrBのωRNAでは、SL2およびSL4、ならびにSL5およびSL7に隣接する一本鎖領域によって2つのシュードノット構造が形成されると予測されます（図4dおよび拡張データ図7a）。シュードノット形成に関与するこの SL4-SL5 シャッフリングは以前に報告されており 4、構造再配置にもかかわらず全体的に同様の構造を維持する ωRNA の構造の堅牢性を強調しています。総合すると、証明された IsrB オーソログの機能性、および IsrB とその ωRNA の予測された構造的類似性は、現在のクライオ EM 構造によって示唆される ωRNA 誘導型 DNA ターゲティング機構の一般性を示しています。

IsrB から Cas9 へのタンパク質ドメインの進化を追跡するために、我々は IsrB の構造を、HNH ヌクレアーゼドメインを含む IsrB の遠い親戚である既知最大の IscB の 1 つ (OgeuIscB)17 の構造、および YnpsCas9 の予測構造と比較しました。 1 (Cas9 の中で IscB に最もよく似た Ga0315277_10040887 からのサブタイプ II-D の初期分岐 Cas9)4 (拡張データ図 8)。 IscB における HNH ドメインの増加とは別に、他の領域でも大きな違いが観察されます。たとえば、IscB の一部のクレード (すべてではありません) の RECL は、IsrB の対応するリンカー領域よりも大きく、最小限の二次構造に折りたたまれますが、YnpsCas9-1 では、REC 領域に大きな球状ドメインが獲得されました。 SpCas9 などの他の Cas9 では、このドメインはさらに大きく、より複雑です。 OgeuIscB の RuvC ドメインには大きなループがいくつか含まれていますが、YnpsCas9-1 では、SpCas9 を含む他の Cas9 の高度に構造化されたドメインにさらに進化したと思われる長い挿入が含まれています。 Cas9 における RuvC ドメインのこの拡大には、PLMP ドメインの喪失が伴います。同様に、WED および TI ドメインは、特にこれらのドメインが拡張されている OgeuIscB および他の大きな IscB を除いて、他の IsrB および IscB では最小サイズを持っています。 WED ドメインと TI ドメインはおそらく、YnpsCas9-1 と SpCas9 に見られる大きな球状バージョンに拡張し続けたと考えられます。 SpCas9 は、共通のコア PAM 相互作用ドメインの下流に位置する余分な球状領域を含む、より大きな PAM 相互作用ドメインを保持しています。 Cas9 における ωRNA のサイズ縮小と二重 RNA ガイド (たとえば、tracrRNA – crRNA) への分割は、おそらく REC ドメインの獲得と Cas9 のすべてのドメインの全体的な拡大を伴ったものと考えられます。

cr/tracrRNA に進化する際の ωRNA の最小化をより詳細に特徴付けるために、DtIsrB ωRNA (DtRNA) の構造を OgeuIscB ωRNA (OgRNA)、CjCas9 シングルガイド RNA (CjRNA)、および SpCas9 sgRNA の構造と比較しました。タンパク質と標的 DNA の結合状態 (拡張データ図 9)16,17,18。トポロジー、位置、二次構造に基づいて、DtRNA の構造的特徴 (S1 ～ 4 および SL1 ～ 8) を他の RNA 種にマッピングし、未確認の構造モチーフをモチーフ 1 ～ 5 (M1 ～ 5) と名付けました。 5' ステム領域 (DtRNA の S1 および SL1) とネクサス領域 (DtRNA の S2) の構造は、4 つの RNA 種すべてで保存されています。 5' ステム領域の上行鎖は、OMEGA-IsrB/IscB から CRISPR-Cas9 への進化的移行において crRNA に置き換えられます。さらに、ωRNA が tracrRNA に進化するにつれて、ネクサス領域内の挿入ヘリックス (DtRNA では S3/S4/SL4/SL5/SL6) が変性し、RNA 構造の圧縮と単純化に寄与しました。 DtRNA と OgRNA の SL4 モチーフは、ωRNA に保存されているネクサスシュードノットを形成しますが、CjRNA M3 の一部の塩基対はそれらのネクサスシュードノットとよく重なっています。 DtRNA 5' ステム領域 (SL2) に埋め込まれたステムループは、ネクサス領域 (SL5) にある埋め込まれたステムループの 1 つと塩基対を形成し、標的 DNA を認識する機能的なシュードノット (アダプターシュードノット) を形成します。アダプターシュードノット（C198）に隣接する1つの塩基は、DNAの6位（G6）および7位（T7）のリン酸部分およびデオキシリボース部分と3～5Åの間でいくつかの接触を形成し（図3a）、 ωRNA 足場は RNA-DNA 二重鎖を認識できます。アダプターのシュードノットは IsrB ωRNA では保存されていますが、IscB ωRNA および Cas9 tracrRNA への移行では変性します。この変化は REC 領域の拡大と相関し、おそらくそれによって補償されます。

また、コンパクトな RuvC 様祖先からの進化の過程での IsrB と Cas9 のドメイン獲得に関連するメカニズムの変化をより深く理解しようと努めました。この目的を達成するために、Thermus Thermophilus RuvC (TtRuvC)、IsrB、CjCas9、SpCas9 の標的結合構造を比較しました (図 5)。 RuvC ドメインを含むタンパク質は、ωRNA と相互作用するように進化するにつれて、TI/PI、PLMP、および BH ドメインを獲得しました。 IsrB と Cas9 の両方の構造において、RuvC、WED、TI/PI、BH ドメインとリン酸ロックループは、同様の構成を持つ機能的コアを形成します。ガイドとターゲットのヘテロ二本鎖と TAM/PAM 二本鎖は、同様の位置と方向でこのコアに結合します。 TI/PI ドメインは TAM/PAM 核酸塩基を認識し、おそらくリン酸ロックループ、BH および ωRNA/gRNA の助けを借りて、標的 DNA の巻き戻しとヘテロ二本鎖形成のためのプライマーとして機能します。 IsrB と Cas9 は相同な RuvC ドメインと BH ドメインを共有していますが、IsrB (および IscB) は、RuvC I と直接相互作用する PLMP ドメインを独自に含んでいます。 IsrB の構造を調べると、塩基の安定化における PLMP ドメインの役割がさらに明らかになります。 ωRNA の末端ヘアピンと Shine-Dalgarno 配列との接触。さらに、IsrB には最小限の RECL 領域と HNHL 領域 (DtIsrB ではそれぞれ 17 アミノ酸と 19 アミノ酸) しか含まれておらず、おそらくこれらは DNA ターゲティングにおいて、Cas9 のより大きな REC ローブや HNH ドメインによって果たされる役割とは異なる役割を果たしていると考えられます (たとえば、625 SpCas ではそれぞれ 135 アミノ酸9)。 SpCas9 では、REC ローブはヘテロ二本鎖との相互作用を通じて標的 DNA を探索し、HNH ドメインとの通信を通じて DNA 結合 RuvC ヌクレアーゼを活性化し、R ループの形成を促進します 19、20、21。しかし、IsrB では、RECL と HNHL が比較的小さいため、このドメイン間コミュニケーションはおそらく骨格間相互作用および塩基間相互作用の両方を介して ωRNA によって助けられていると考えられます。

祖先のRuvCヌクレアーゼからIsrB、そしてCas9への進化の構造決定因子。各ファミリーの現代の子孫 (現存体) の例を、T. サーモフィラス RuvC (TtRuvC、PDB 6S16)、DtIsrB、CjCas9 (PDB 5X2G)、および SpCas9 (PDB 7S4X) から始めて示します。 TI、PLMP、BH ドメインの挿入、ωRNA との相互作用、HNH ドメインの挿入、PLMP ドメインの喪失、ωRNA のさまざまな部分の REC 領域 (ドメイン) による置換など、提案された進化の過程における重要な段階が示されています。置換はカラーキーで示されます)。 DtIsrB ωRNA の SL2 を置き換える CjCas9 および SpCas9 の REC2 の部分は、濃い灰色で色付けされています。接続された塩基対は、ガイド DNA 二重鎖についてのみ示されています。 RNA-DNA 二重鎖近くの位置を強調するために、ωRNA アダプターのシュードノットの切断された塩基対が示されています。

比較的大きなωRNA（Cas9が使用する100ntのsgRNAと比較して約300nt）は、小さなRECLおよびHNHL領域を補い、DNAターゲティングとニッキング活性の間の関連に寄与していると考えられます（拡張データ図10）。多層のωRNA構造では、上層のRNAヘリックス（S2/S3/S4/SL2/SL4/SL5）は、ωRNAによるヘテロ二本鎖認識のための相互作用ネットワークを形成し、下層のRNAヘリックス（SL7/ SL8) を形成し、S2、SL4、および SL7 の間のネクサスシュードノット相互作用によってニッキングモジュール (PLMP/RuvC/TI ドメイン) と広範囲に相互作用します。 ωRNAのアダプターシュードノットの変異によりIsrBのニッキング活性が消失したことを考えると（図2d）、たとえシュードノットが標的DNAから離れていても、ωRNAの構造モチーフは、ωRNA/によるDNAセンシングのアロステリック制御にとって重要である可能性があります。 RECL および RuvC ヌクレアーゼドメインによる DNA ニッキングは、さらなる形態の制御を統合する手段を提供します。このωRNA駆動のアロステリック制御機構は、全体的に高い表面電荷と、IsrBがωRNAと接触する面積によって支えられている。グループ I イントロン、グループ II イントロン、リボヌクレアーゼ P などの他の大きな (約 400 ～ 900 nt) 機能的非コード RNA は複雑な三元構造を持ち、その周辺領域はアロステリック機構によって中央の触媒コアを制御できます 22,23,24 、25。触媒活性のある IsrB R ループ複合体など、他の立体構造における IsrB の今後の構造研究により、この仮説が検討され、OMEGA システムの機構的理解が深まるでしょう。

全長 DtIsrB (残基 1 ～ 353) をコードする遺伝子をコドン最適化し、合成し (Twist Bioscience)、修飾 pC013 ベクター (Addgene Plasmid no. 90097) にクローニングしました。 DtIsrB コーディング領域は、His6-Twinstrep タグ、SUMO タグ、DtIsrB および GFP タグで構成されます。野生型 DtIsrB は、Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS 細胞 (Novagen) 内で 18 °C で発現されました。大腸菌をルリア・ベルターニ培地（100 mg l-1 アンピシリンを含む）で 37 °C で OD600 が 0.5 に達するまで培養し、その後 0.1 mM イソプロピル-β-d-チオガラクトピラノシドを添加してインキュベートすることによりタンパク質発現を誘導しました。 18℃で20時間。大腸菌細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾールおよび１ＭＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理により溶解し、次いで遠心分離した。上清をNi-NTAアガロース(Qiagen)と混合した。タンパク質結合カラムをバッファー A、バッファー B (50 mM Tris-HCl、pH 8.0、20 mM イミダゾールおよび 0.3 M NaCl)、およびバッファー C (50 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.3 M イミダゾールおよび 0.3 M NaCl) で洗浄しました。ＮａＣｌ）。タンパク質を緩衝液Ｄ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．３Ｍイミダゾールおよび１ＭＮａＣｌ）で溶出した。 DtIsrB の同族 ωRNA を、PCR 増幅した DNA テンプレートと HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis キット (NEB) を使用して、T7 RNA ポリメラーゼで in vitro 転写しました。テンプレートは、T7 プロモーター (TAATACGACTCACTATAGG)、ガイド (GCCTTATTAAATGACTTCTC) (残基 1 ～ 20)、および ωRNA 足場 (残基 21 ～ 282) で構成されます。転写されたRNAは、RNeasyキット(Qiagen)を製造業者の指示に従って使用して精製した。標的および非標的 DNA 鎖 (それぞれ、GATCAGCTCAAGAGAAGTCATTTAATAAGGC および TTGAGCTGAT) は GENEWIZ から購入しました。複合体 A を再構成するために、精製した DtIsrB タンパク質を、緩衝液 E (10 mM Tris-HCl、pH 8.0および50 mM NaCl、5 mM MgCl2)を加え、37℃で15分間インキュベートしました。複合体Ａを、緩衝液Ｆ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．０および５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ２）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。複合体 A (最終濃度: 0.1 mg ml-1) を BS3 (最終濃度: 0.5 mM) と 4 °C で 2 時間インキュベートしました。複合体 B を再構成するために、ラムダ N タンパク質 (MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN) を DtIsrB と GFP タグの間に挿入しました。 ωRNA 足場の残基 34 ～ 67 (残基 21 ～ 282) が GAAA リンカーに置き換えられました。 GAAA リンカー融合 boxB RNA (GAAAGCCCUGAAGAAGGGC) (残基 283 ～ 302) を ωRNA 足場の 3' 末端に付加しました。この再構成には同じ標的 DNA 鎖を使用しました。 5' 伸長非標的 DNA 鎖 (TACTGAAGAGTTGAGCTGAT) は GENEWIZ から購入しました。精製した DtIsrB タンパク質を、緩衝液 G (10 mM Tris-HCl、pH) 中で、ωRNA、標的 DNA 鎖、および非標的 DNA 鎖 (TTGA TAM) (モル比、2.3:1:1.5:1.5) と混合しました。 8.0 および 50 mM NaCl) を加え、37 °C で 15 分間インキュベートしました。複合体 B は、バッファー G で平衡化した同じサイズ排除カラムによって精製しました。グリッド調製のために、精製した複合体 A および B 溶液 (0.1 mg ml-1、3 μl) を、新しくグロー放電させた UltrAuFoil 300 メッシュ R1.2 に適用しました。 Vitrobot Mark IV (FEI) の /1.3 グリッド (Quantifoil)、4 °C、湿度 95%、待機時間 0 秒と 10 秒、ブロッティング時間 2 秒と 4 秒。

複合体 A のクライオ EM データは、HHMI Janelia Research Campus で、300 kV で動作し、Gatan 生物量子エネルギーフィルター (Gatan) およびポストフィルター K3 直接電子検出器 (Gatan) を備えた Titan Krios G2 顕微鏡 (Thermo) を使用して収集されました。電子計数モード。各ビデオは公称倍率 ×105,000 で記録され、1 秒あたり 12.075 電子/Å2 の電子露光で物理ピクセルあたり 0.839 Å (超解像度ピクセルあたり 0.4195 Å) に相当し、総露光時間は 5.0 秒でした。累積露光量は 60 e-/Å2 です。次に、ビデオあたり 50 フレームをフレームあたり 1.2 e-/Å2 線量で収集し、ビデオあたり合計 60 e-/Å2 線量になりました。公称デフォーカス範囲は -0.8 ～ -2.2 μm に設定されました。自動データ収集は、SerialEM のスクリプトを使用して実行されました。各ステージ位置について、イメージシフトを使用して 9 ホールからデータを収集し、ホールごとに 2 回のビデオ取得を行いました。画像シフトによるビーム傾斜が校正され、データ収集中にビーム傾斜補正が適用されました。複合体 B のクライオ EM データは、200 kV で動作し、リニアモードの Falcon 3EC 直接電子検出器 (Thermo) を備えた Talos Arctica G2 顕微鏡 (FEI) を使用して MIT.nano で収集されました。各ビデオは公称倍率×120,000で記録され、3.99秒間24.54 e-/pix s-1の電子露光で1.2550Åの校正ピクセルサイズに相当し、62.53 e-/Å2の累積露光となった。次に、ビデオあたり 20 フレームをフレームあたり 3.1265 e-/Å2 の線量で収集し、ビデオあたり合計 62.53 e-/Å2 の線量を取得しました。公称デフォーカス範囲は、-2.6 ～ -1.0 μm に設定されました。自動データ収集は、EPU ソフトウェア (Thermo) を使用して実行されました。ステージ位置ごとに、イメージシフトを使用して 9 つのホールからデータを収集しました。複合体 A の 3D 再構成を取得するために、データは RELION-4.0 を使用して処理されました (参考文献 26)。ビデオフレームは 5 × 5 パッチに配置され、MotionCor2 で線量重み付けが行われました (参考文献 27)。デフォーカスパラメータは CTFFIND-4.1 によって推定されました (参考文献 28)。前処理された 4,142 枚の顕微鏡写真から、TOPAZ ベースの自動ピッキング 29 によって 1,626,574 個の粒子がピックアップされ、3.146 Å ピクセル -1 で抽出されました。次に、選択された 107,066 個の粒子が 1.144 Å ピクセル -1 で再抽出され、アラインメントなしで 1 回の 3D リファインメントと 3D 分類が行われました。選択された 58,188 個の粒子に対して、粒子ごとのデフォーカス推定とベイジアン研磨が行われました。ビーム傾斜を調整するために、各顕微鏡写真の光学グループは、ステージからの穴の位置に基づいて設定されます。研磨された粒子は 3D リファインメントを受け、フーリエシェル相関 0.143 基準に従って 3.10 Å のグローバル解像度のマップが得られました。複合体 B の 3D 再構成を取得するために、同じプログラムを使用してデータが処理されました。動き補正され線量加重された 2,542 枚の顕微鏡写真から、TOPAZ ベースの自動ピッキングによって 1,595,800 個の粒子がピックアップされ、3.138 Å ピクセル -1 で抽出されました。これらの粒子は、数回の 2D および 3D 分類を受けました。次に、選択された 50,661 個の粒子が 1.255 Å ピクセル -1 で再抽出され、cryoSPARC30 を使用して均一精製され、フーリエシェル相関 0.143 基準に従って 6.85 Å のグローバル解像度のマップが得られました。

初期のタンパク質モデルは、ColabFold データベースで相同体を検索するためにデフォルトのパラメーターと MMseqs2 を使用する ColabFold フレームワークの下で AlphaFold2 (参考文献 31) を使用して生成され、複合体 A の密度マップに対して COOT33 と ISOLDE7 を使用して手動で修正されました。モデルは、複合体 A の密度マップと ωRNA8 の共分散に基づく二次構造モデルを使用して auto-DRRAFTER で構築されました。 ωRNA (クエリ) の二次構造は、-max オプションを指定した cmsearch34 を使用して予測され、以前の研究から最高スコアの IscB/IsrB ωRNA 共分散モデルを特定しました4。最良のモデルでは、モデルに一致するクエリ領域に、モデルの予測から二次構造が割り当てられました。塩基のアイデンティティの 1 つがギャップ文字に等しい塩基対に誤って割り当てられていることが判明したステムループの二次構造は、二次構造を持たないものとして再割り当てされました。次に、ネクサスを越えた 3' 末端の低保存領域を除いて、カバレッジのないクエリ領域 (最良の共分散モデルと一致しない 8 bp 以上) の二次構造を、mfold35 を使用して予測しました。擬似ノットは、所定の ωRNA タイプに予想される擬似ノットの位置で一致する塩基対を特定することによって手動で割り当てられました。 ωRNA 座標は、すべての非標準塩基対と単一塩基対のみからなるほとんどのヘリックスが削除された共分散ベースの二次構造モデルのわずかに修正されたバージョンから開始して auto-DRRAFTER でモデル化されました。この二次構造のドット括弧表記を以下に示します。

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auto-DRRAFTER は DNA ヌクレオチドをモデル化できないため、すべての DNA ヌクレオチドは RNA としてモデル化されました。ガイド/ωRNA 足場/ターゲット DNA/非ターゲット DNA は、それぞれ残基 1 ～ 20/21 ～ 282/283 ～ 313/314 ～ 323 に割り当てられました。モデリングに使用した完全な RNA 配列を以下に示します。

ggccuauuaaaugacuucucgucaaccaccccugacugaagucagaggcuugcuucuggccugaguugggggcccgguuuggcggggccggggcaacuggcugaccaggcggcccgguucgccgggcaggguuccgcggggcuaccaaggacuuccggguguuucgccagcccggacuaucuccggcagaaccgcucaaugccgcggccggccaagaccggccua agccccugcggacagcgccgaggcgacaaucacuccgaaaggaggccguguauucggcgaucagcucaagagaagucauuuaauaaggcuugagcugau

Auto-DRRAFTER モデリングは、タンパク質密度に対応する領域が削除された密度マップを使用して、タンパク質座標の非存在下で実行されました。モデリングの最初のラウンドはすべて、予備的な 4.3 Å 解像度の密度マップで実行されました。モデリングは、残基 W:1 ～ 14 W:41 ～ 48 W:53 ～ 60 W:258 ～ 269 W:271 ～ 281 X:2 ～ 11 X:18 ～ 31 Y:1 に対応するヘリックスをフィッティングすることによって手動で設定されました。密度マップに -10。自動 DRRAFTER モデリングの 2 回目のラウンドでは、残基 W:41 ～ 48 および W:53 ～ 60 に対応するヘリックスが最初の配置から移動することが許可されました。 5 ラウンドのモデリングが実行され、続いて最後の 1 ラウンドのモデリングが実行されました。各ラウンドで 2,000 ～ 6,000 のモデルが構築されました。上位 10 のスコアリングモデルのうちの 1 つが、タンパク質モデルとともに ISOLDE および Phenix6 によるさらなる改良のために選択され、形状が最適化され、クライオ EM 密度への適合性が向上しました。最適化されたモデルと共分散に基づく二次構造を検査した後、最後の 1 ラウンドを含むさらに 2 ラウンドの自動 DRRAFTER モデリングを実行しました。この際、アダプターのシュードノットの塩基対がわずかに変更され、残基 81 ～ 84 および 194 ～ 197 が追加されました。残基 81 ～ 84 および 193 ～ 196 ではなく、対になっていました。この追加のモデリングでは、残基 W:73 ～ 99 および W:186 ～ 206 のみが再構築されました。他のすべての残基は固定されたままでした。モデリングのもう 1 つの最終ラウンドは、4 Å までローパスフィルター処理された 3.1 Å 解像度の密度マップを使用して実行されました。これらのモデルの最終的な収束 (モデル間のペアごとの二乗平均平方根偏差) は 4.1 Å です。 Auto-DRRAFTER 収束値は、モデルの精度を予測することが以前に示されています。事前に決定された収束とモデル精度の間の線形関係 (精度 0.61 × 収束 + 2.4 Å) を使用すると、これらの最初の計算生成モデルの推定精度は 4.9 Å になります。精度をさらに向上させるために、これらのモデルの 1 つを COOT、ISOLDE、およびタンパク質とともに Phenix で精製し、最終的な IsrB-ωRNA-ターゲット DNA 複合体モデルを作成しました。最終モデル (タンパク質残基 1 ～ 5/211 ～ 224/348 ～ 353、RNA 残基 1 ～ 2/37 ～ 64/119 ～ 122/212 ～ 219/263 ～ 265、およびターゲット DNA 残基 1/30 ～ 31 を欠いている)分解が不十分で最終モデルから省略されたもの）は、MolProbity36 および Q-score37 によって評価されました。分子グラフィックスと EM 密度図は、CueMol (http://www.cuemol.org)、PyMOL (https://pymol.org/2/)、UCSF Chimera (https://www.cgl.ucsf.edu) を使用して作成されました。 /chimera/) またはキメラ X (https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/)。

IsrB タンパク質と ωRNA テンプレートは、in vitro 転写/翻訳発現システム用に調製されました。 IsrB タンパク質テンプレートは、T7 プロモーターと翻訳開始配列 (GCGAATTAATACGACTCACTATAGGGCTTAAGTATAAGGAGGAAAAAATATG)、IsrB ORF 配列および T7 ターミネーター配列 (CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG) で構成されます。 ωRNA テンプレートは、T7 プロモーター配列 (GGAAATTAATACGACTCACTATAGG) と ωRNA 配列で構成されます。 IsrBタンパク質およびωRNAテンプレートを、改変pC013ベクター(Addgene Plasmid no. 90097)およびpCOLADuet-1ベクターに埋め込んだ。 IsrBタンパク質およびωRNAの変異はPCRベースの方法によって導入され、配列はDNA配列決定によって確認されました。 20 nt の標的配列と TAM を含み、5' IRDye 700 (IDT) で蛍光標識された 320 bp PCR アンプリコン (30 ng) を、IsrB タンパク質テンプレート (50 ng) および ωRNA とインキュベートしました。 PURExpress In vitro Protein Synthesis Kit (NEB) の 5 μl 溶液 A と 3.75 μl 溶液 B を含む 12.5 μl の反応バッファーにテンプレート (125 ng) を加えます。反応条件は以下のように最適化した。図 2d、3 時間: 37 °C で 2 時間、60 °C で 1 時間。図 3c、2.1 時間: 37 °C で 2 時間、60 °C で 5 分。図 3h、3h: 37 °C で 2 時間、60 °C で 1 時間。図 4c (CwIsrB、DsIsrB および BbIsrB)、37 °C で 6 時間。図 4c (CsIsrB)、6 時間: 37 °C で 2 時間、60 °C で 4 時間。図 4c (K2IsrB) および 37 °C で 2 時間。 DtIsrB は、60 ～ 80 °C で生育する好熱性微生物 D. サーモクニクリに由来します (参考文献 38)。３μｇのＲＮａｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ）および０．２４単位のプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）を添加することによって反応を停止させた。反応生成物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) を使用して精製し、Novex 10% TBE-尿素ゲル (Invitrogen) で分離し、その後 ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) を使用して視覚化しました。欠失変異体のタンパク質の安定性を調べるために、クライオ EM サンプルの調製に使用される細菌発現系で IsrB タンパク質が生成されました。大腸菌細胞を緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭイミダゾールおよび１ＭＮａＣｌ）に再懸濁し、超音波処理により溶解し、次いで遠心分離した。上清をMagneHisビーズ(Promega)と混合した。タンパク質が結合したカラムをバッファー A で洗浄しました。タンパク質をバッファー B (50 mM Tris-HCl、pH 8.0、0.3 M イミダゾールおよび 1 M NaCl) で溶出し、SDS-PAGE で分析しました (拡張データ図 5b)。 IsrB DNA 切断部位を決定するために、20 nt の標的配列 (GCCTTATTAACCTCAGCCTC) および TAM を含む 816 bp PCR アンプリコン (400 ng) を、IsrB タンパク質テンプレート (100 ng) および ωRNA テンプレート (125 ng) とインキュベートしました。 ) PURExpress In vitro Protein Synthesis Kit の 10 μl 溶液 A と 7.5 μl 溶液 B を含む 25 μl の反応バッファーに溶解します。反応生成物を精製した後、ニックの入った生成物をNb.BbvCI (NEB)を使用して切断した。切断された生成物をゲル抽出し、精製し、DNA 配列決定 (GENEWIZ) によって分析しました。

無傷のRuvC活性触媒部位残基を有し、切断の兆候がない代表的なIsrBは、G1b、G1cおよびG1h型のωRNAを有するIsrBに対応する、以前の研究4で同定されたIsrBの3つの主要クレードの中から選択されました。各 IsrB に対応する ωRNA は、以前の研究 4 の予測から取得され、ωRNA の終わりが IsrB の開始点になるように修正されました。次に、mfold によって決定された対応する ωRNA の二次構造が、指定された ωRNA タイプの共分散に基づく ωRNA 二次構造に見られる保存されたステムループおよびシュードノット (手動で特定されたもの) を含まない場合、IsrB は廃棄されました 35。分析により、CwIsrB、CsIsrB、DsIsrB、BbIsrB、K2IsrB 配列および対応する ωRNA が特定されました。 DtRNA について説明したように、共分散に基づいた二次構造および擬似ノットの予測を、対応する ωRNA について決定しました。次に、すべての ωRNA を forna39 を使用して視覚化しました。

PLMP ドメインの分析では、HHPred で DtIsrB PLMP ドメインのリモートホモログが検索され、IF-3 が推定上のリモートホモログであることが特定されました。 IscB/IsrB ファミリーの IF-3-N 末端領域および PLMP ドメインを含む代表的な配列を UniProt および国立バイオテクノロジー情報センターから入手し、MAFFT-einsi を使用してアラインメントしました。構造の代表的なものは、pymol スーパー機能を使用して位置合わせされ、重ねられました。

TAM 同定アッセイは、前述のように調製された TAM ライブラリを使用して実行されました4。 20 nt の標的配列 (GCCTTATTAACCTCAGCCTC) の下流にランダム化された 8 つのヌクレオチドを含む一本鎖 DNA オリゴヌクレオチド (IDT) を、PrimeSTAR Max DNA ポリメラーゼ (Takara) によるフィルインによって dsDNA に変換し、Gibson クローニング (NEB) によって pUC19 にクローニングしました。 ) を使用して TAM ライブラリを生成します。インビトロ切断実験セクションで説明したように、IsrB タンパク質 (50 ng) および ωRNA (125 ng) テンプレートを含むインビトロ転写/翻訳発現系を使用して、ライブラリー (25 ng) を消化しました。 CwIsrB、DsIsrB、CsIsrB、BbIsrB、および K2IsrB の反応を 4 時間インキュベートしました: 37 °C で 2 時間、50 °C で 1 時間、および 60 °C で 1 時間。 DtIsrB の反応を 3 時間インキュベートしました: 37 °C で 2 時間、60 °C で 1 時間。次いで、３μｇのＲＮａｓｅＡ（Ｑｉａｇｅｎ）および０．２４ユニットのプロテイナーゼＫ（ＮＥＢ）を添加することによって反応を停止した。反応生成物は、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) を使用して精製し、Nb.BbvCI (NEB) を使用して消化しました。精製した反応産物は、NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (NEB)、NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB)、および NEBNext Adaptor for Illumina (NEB) を使用して末端標識およびアダプターライゲーションを行いました。。 USER 酵素 (NEB) で消化および精製された DNA は、TAM ライブラリーバックボーンに特異的な 1 つのプライマーと NEBNext アダプターに特異的な 1 つのプライマーを使用した 12 サイクル PCR で増幅され、その後の 18 サイクル PCR で Illumina i5 が追加されました。アダプタ。 8N 縮重フランキング配列の分布を正規化するために、ライブラリーバックボーンに特異的なプライマーを使用した 12 サイクル PCR でライブラリープラスミドを増幅し、その後 Illumina i5 アダプターを追加する 18 サイクル PCR で増幅しました。増幅されたライブラリーを2%アガロースE-ゲル(Invitrogen)上で単離し、MiSeqシーケンサー(Illumina)上で配列決定した。得られた配列データは、6 ヌクレオチドの TAM 領域を抽出し、個々の TAM をカウントし、各サンプルの合計リードに対して TAM を正規化することによって分析されました。配列モチーフは、前回のレポートで使用したカスタム Python スクリプトを使用して、最高スコア部分で選択した TAM を使用して生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

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クライオ EM グリッドの準備とデータ収集の支援については、E. Brignole、C. Borsa、X. Zhao、S. Yang に感謝します。標本の準備と画像化は、アーノルド・アンド・メイベル・ベックマン財団からの資金援助の一部を受けて設立された MIT.nano の極低温電子顕微鏡施設で行われました。有益な議論とサポートをしてくださった張研究室のメンバー全員に感謝します。 SHはJSPS海外特別研究員制度の支援を受けています。 KK は、Rhodes Trust および HHMI Hanna H. Gray Fellows Program と提携した Schmidt Science Fellows によって支援されています。 FZ は国立衛生研究所によって支援されています (助成金番号 1DP1-HL141201 および 2R01HG009761-05)。ハワード・ヒューズ医学研究所。マサチューセッツ工科大学のポイトラス精神障害研究センター。 MITのホック・E・タンとK・リサ・ヤン自閉症研究センター。マクガバンのヤンタン分子治療センター、BT慈善財団、フィリップス家、J.ポイトラスとP.ポイトラスによるもの。

以下の著者も同様に貢献しました: 平野誠一、Kalli Kappel

MIT とハーバード大学のブロード研究所、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ

平野誠一、カリ・カッペル、ハン・アルテトラン、ウィリアム・フォーレ、マックス・E・ウィルキンソン、ソウミャ・カンナン、F・エズラ・デミルチョグル、リアノン・K・マクレー、フェン・チャン

米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、MIT マクガバン脳研究所

マサチューセッツ工科大学脳認知科学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

マサチューセッツ工科大学生物工学部、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

ハワード・ヒューズ医学研究所、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国

CryoEM 共有リソース、ハワードヒューズ医学研究所、ジャネリアリサーチキャンパス、米国バージニア州アッシュバーン

Rui Yan、塩崎桃子、Zhiheng Yu

国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国

キラ・S・マカロワ & ユージーン・V・クーニン

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SH と FZ がこのプロジェクトを発案しました。 SH、KK、GF、HA-T.、MEW、SK、FED、KSM が実験を設計、実行し、結果を分析しました。 RY、MS、ZY がデータ収集を実施しました。 FZ は RKMSH、RKM、EVK の支援を受けて研究と実験計画を監督し、FZ はすべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

フォン・チャンへの対応。

FZ は、Editas Medicine、Beam Therapeutics、Pairwise Plants、Arbor Biotechnologies、Proof Diagnostics の科学顧問兼共同創設者です。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Malcolm White 氏、David Taylor 氏、その他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) 複合体 A の単一粒子分析のための Cryo-EM データ処理の概略図。最終的な 3D リファインメントにおけるシャープ化されていない (左) マップとシャープ化された (右) マップ。粒子の配向分布 (中央)。 (b) FSC 閾値 0.5 を使用して RELION-4.0 で計算された、局所解像度によって色分けされた最終精製マップ。(c) RELION-4.0 での最終ラウンドの精製からの複合体 A の半分のマップ間で計算された FSC 曲線。 (d) phenix.validation_cryoem を使用して、モデルと最終的な洗練されたマップの間で計算された FSC 曲線。（ e ）IsrB-ωRNA-DNA複合体の3.1ÅマップにおけるIsrB-ωRNA-標的鎖DNA-非標的鎖DNAモデルの各残基のQスコア。プロット内の黒と灰色の破線は、それぞれグローバルマップ解像度 (3.1 Å) とローカルマップ解像度 (4.5 Å) に基づいて予想される Q スコアを表します。 RNA および DNA 残基の Q スコアは、ローカルマップ解像度に基づく期待値と一致しています。

残留物のクライオ EM 密度マップを主要な図に示します。

(a) IsrB タンパク質構造の拡大図。 (b) DNA 結合 IsrB-TI ドメインと SpCas9-PI ドメインの構造比較 (PDB: 7S4X)。 Cas9 構造では、わかりやすくするために β6 と β7 の間に挿入されたサブドメインが省略されています。

(a) DtIsrB の PLMP ドメインに対応するシード配列 SITRVPVVGVDGRPLMPTTPRKARLLIRDGLAVPRRNKLGLFYIQMLRPVGTRTQ を使用した HHPred 検索の上位 5 件のヒット。 (b) DtIsrB の PLMP ドメインと Geobacillus stearothermophilus の翻訳開始因子 3 (IF-3) の N 末端ドメインの構造比較 (PDB: 1TIF)。 (c) 代表的な IF-3 N 末端ドメインと OMEGA 関連の PLMP ドメインのアライメント。

(a) ニックの入った DNA 産物を分離するための変性 PAGE ゲル。 (b) 欠失変異体の発現チェック用の SDS-PAGE ゲル。図 3c に関連します。

(a) サンガー配列決定法による標的 DNA の切断部位。切断部位は黒い三角形でマークされています。追加の非鋳型アデニンは、サンガー配列トレースではアスタリスクで示されます。 (b) λN-IsrB 融合タンパク質のドメイン構造 (左) および ωRNA 変異体と標的 DNA の概略図 (右)。 ωRNA 変異体では、残基 34 ～ 67 が GAAA に置換され、boxB RNA が ωRNA 足場の 3' 末端に付加されました。 (c) 複合体 B の単一粒子分析のための Cryo-EM データ処理の概略図 (左)。最終的に洗練されたマップ (右)。 (d) cryoSPARC v3.3 での最終ラウンドの改良からの複合体 B のハーフマップ間で計算された FSC 曲線。 (e) 複合体 B のクライオ EM 密度マップ。複合体 B マップと複合体 A モデルの重ね合わせに基づいて、タンパク質、RNA、および DNA の領域が割り当てられました。余分な密度がωRNA SL8領域の近傍で観察され、SL8-boxB接続性およびλN-boxB体積と一致して、λN-boxB複合体に割り当てられました(PDB:1QFQ)。 TS、ターゲット鎖。 NTS、非ターゲット鎖。 (f および g) 複合体 A (f) およびその同族 RNA および標的 DNA と複合体を形成した SpCas9 (EMD: 24838) (g) のクライオ EM 密度マップ。

(a) 共分散モデルに基づいた ωRNA 足場の二次構造とシュードノットの予測。 CwIsrB/DsIsrB/BbIsrB ωRNA では、SL3 モチーフが不対のヌクレオチドに置き換えられます。 CsIsrB/K2IsrB/BbIsrB ωRNA では、SL6 モチーフが変性し、SL8 モチーフが不対のヌクレオチドに置き換えられます。 (b) DtIsrB の AlphaFold (AF) 構造とクライオ EM (EM) 構造の重ね合わせ。 (c) 6 つの IsrB オルソログの AlphaFold 構造の重ね合わせ。 CwIsrB/DsIsrB は、それぞれ RuvC ドメインと RECL に β ヘアピンとループの挿入を持っています。

DtIsrB、OgeuIscB (8CSZ)、YnpsCas9-1 (AF2 モデル)、および SpCas9 (PDB: 4OO8) の構造比較。

タンパク質/DNA 結合状態における DtIsrB、OgeuIscB (8CSZ)、CjCas9 (5X2G)、および SpCas9 (7S4X) の同族 RNA 間の構造比較。全体構造（左）。 RNA の構造 (中央)。 RNA の模式図 (右)。

IsrB と Cas9 の機構の類似点と相違点を強調した概略図。

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転載と許可

平野、S.、Kappel、K.、Altae-Tran、H. 他 ωRNAおよび標的DNAと複合体を形成したオメガニッカーゼIsrBの構造。 Nature 610、575–581 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05324-6

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受信日: 2022 年 4 月 20 日

受理日: 2022 年 9 月 6 日

公開日: 2022 年 10 月 12 日

発行日: 2022 年 10 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05324-6

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