ホルモン避妊薬の使用に関するバイオマーカーを開発するための新しいアプローチ

Jul 22, 2023

Scientific Reports volume 13、記事番号: 245 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

尿および唾液中のホルモン避妊薬（HC）使用のバイオマーカーを特定するために、我々は、併用経口避妊薬（COC）またはデポ型酢酸メドロキシプロゲステロン（DMPA）を含むレボノルゲストレル（LNG）の投与を開始する30人の女性（1グループあたり15人）を対象にパイロット研究を実施した。確立された COC 薬物動態に基づいて、COC 摂取前と使用 1 日目と 3 日目、または DMPA 注射前と注射後 21 日目と 60 日目に血清と尿のサンプルを収集しました。液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析 (LC-MS/MS) を使用して、血清/尿の LNG および MPA を測定しました。 LNG はベースラインでは検出できませんでした (特異度 100%)。摂取後、ほとんどの尿サンプルで検出可能な LNG レベルが検出されました (感度: 1 回目の投与後 6 時間で 80%、3 回目の投与後 6 時間で 93%)。 DetectX LNG イムノアッセイキットを使用したところ、尿中 LNG の測定感度は 100% でした。尿中 MPA レベルは、ベースライン時に 14/15 人の女性で検出できませんでした (特異度 91%)。注射後、すべての尿サンプルで検出可能な MPA レベルが検出されました (感度: 21 日および 60 日で 100%)。結果は、尿サンプリングを使用して、LNG および MPA の使用のバイオマーカーを特定できることを示唆しています。 24 時間後の唾液のトランスクリプトームプロファイルに影響を与える変化を示す他のステロイドホルモン研究からの証拠に基づいて、我々は同じ (COC、DMPA) 時点を使用して唾液を収集しました。トランスクリプトーム解析を実施したところ、ベースラインと比較して21日目と60日目にDMPAユーザーの唾液で発現量が異なるいくつかの遺伝子が検出されました。 COC ユーザーの間では誰もいませんでした。私たちは、DMPA使用のHCバイオマーカーとしての唾液における差次的遺伝子発現のさらなる研究を計画しており、COCの使用期間と唾液収集時間の長期化、およびCOCバイオマーカーとしての唾液の使用をサポートするためのマイクロRNAシーケンスの応用を検討する予定です。

避妊薬の使用に関する正確なデータは、公衆衛生の目標の確立、臨床ケアの提供、臨床研究の実施に影響を与えます。公衆衛生の分野では、避妊普及率 (CPR) に関する統計は、性と生殖に関する保健サービスに関する国内および国際的な現実的な目標を達成するための計画に影響を与えます 1、2、3。 CPR データの正確性は、避妊具の使用率が高いと報告されているにもかかわらず、妊娠率が依然として高い地域では特に重要です。その結果、産科および新生児の臨床ケアサービスの提供が、地域、地域、または国のニーズに見合わない可能性があります4、5、6。避妊の使用に関する情報へのアクセスは、個々の家族計画の目標を達成するのに最適な避妊方法の選択に関して、臨床医とクライアントの間で意思決定を共有することも促進します7。臨床試験に関しては、ある方法の使用に関してボランティアから得られたデータは、安全性、有効性、および許容性の結果を分析および報告するための基礎を構成し、新しい方法の承認に関する規制当局の審査および決定の基礎となります8。

避妊薬使用情報の全体的な重要性を考慮して、多くの研究者が、自己報告に基づく正確なデータの取得に関連する継続的な課題について考察しています7、8、9、10、11、12、13。最近、何人かの研究者が正確なデータを取得することでより有望な結果を報告していますが、自己申告による避妊薬の使用を検証するために客観的な尺度の使用を推奨しています 14,15。サンプル中の合成プロゲスチン (ホルモン避妊薬の有効成分) の血清濃度レベルの測定は、ホルモン避妊薬 (HC) の使用を評価するための「ゴールドスタンダード」16 と考えられています。しかし、そのような検査は侵襲的な静脈穿刺を必要とし、外因性ホルモン濃度を評価する特別な能力を備えた研究室に依存しており、世帯調査や数千人の参加者による後期臨床試験での使用には非現実的である。尿中のホルモンレベルを測定するための研究的アプローチが開発されていますが、臨床ケアの状況では内因性プロゲステロンとエストロゲン（エストラジオールなど）のサンプリングに依存する傾向があります17。よく説明されているように、内因性ステロイドホルモンと合成ステロイドホルモンはどちらも主に肝臓で代謝され、一部は抱合代謝産物および無傷のホルモンとして尿中に排泄されます。私たちは、十分に説明されている高感度の方法を使用して、ホルモン使用のマーカーとして尿サンプル中のこれらのホルモンまたはその代謝産物を測定できると期待しました 17、18、19、20。具体的には、検証済みの液体クロマトグラフィー質量分析 (LC-MS/MS) 手法を使用して、血液と尿の両方のサンプル中の LNG および MPA レベルを測定できるのではないかと推測しました。また、高感度 LNG 酵素免疫測定キット (DetectX、Arbor Assays、米国ミシガン州) は、尿中の免疫反応性 LNG を測定します。そこで我々は、血清よりも簡単かつ費用効率よく採取できる尿を、多くの併用経口避妊薬に含まれるレボノルゲストレル（LNG）などのプロゲスチンを配合した一般的に使用される避妊薬の客観的バイオマーカーとして使用できるかどうかを検討した。（ＣＯＣ）、または注射用製剤に使用される酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、例えば、デポ−酢酸メドロキシプロゲステロン（ＤＭＰＡ）。

また、唾液は単なる血漿限外濾過液ではなく、タンパク質、ホルモン、抗体、その他の分子化合物のライブラリー全体も含まれているため、バイオマーカーを同定するために唾液を使用する可能性も検討しました。これは、トランスクリプトミクスを応用して差次的な遺伝子発現を分析するための理想的なマトリックスです21。私たちは、LNG や MPA などの合成ステロイドホルモンが受動拡散によって唾液に入るという理論を立てました。ただし、予想される濃度は血液に比べて低く、血清や尿のサンプルに一般的に適用される ELISA などの方法を使用して確実に測定することはできません。また、ホルモン避妊薬の使用により、唾液中のトランスクリプトームプロファイルが変化し、そのような変化が避妊薬曝露の潜在的なバイオマーカーとして機能する可能性があると考えました。私たちは、RNA シークエンシングを使用して、ホルモン避妊薬を使用している個人から採取した唾液サンプル中の発現差のある遺伝子 (DEG) を同定できるのではないかと推測しました 22、23、24、25。

したがって、我々は、COC または DMPA を使用している個人から採取した尿検体中のホルモンまたはその代謝物を測定するために検証済みの検査を使用できるかどうかを判断するために、横断的、非盲検のパイロット研究を実施しました。また、唾液サンプルを使用した RNA シーケンスを使用して、ホルモン避妊薬の使用のマーカーとして発現の異なる遺伝子を検出する可能性も調査しました。

この研究は、人口評議会の治験審査委員会、ドミニカ共和国のプロファミリア（研究施設）の倫理委員会、およびドミニカ共和国の国立医学研究機関であるCONABIOSによって承認されました。各参加者は、スクリーニング手順を受ける前に、書面によるインフォームドコンセントを提出しました。この研究は、ヘルシンキ宣言、国際調和会議の適正臨床実施ガイドライン、および臨床研究に関する米国連邦規則に従って実施されました。

研究期間中にDMPAまたはCOCを開始することに関心のある女性を募集し、2つのグループ（1グループあたり15人）を登録しました。グループAの患者はエチニルエストラジオールとLNGを含むCOC（EE：30μgおよびLNG 150μgのMicrogynon-Bayer、ドイツ）を使用し、グループBの患者はDMPA 150mg（ファイザー・マニュファクチャリング・ベルギーNV、ベルギー）を筋肉内投与して使用した。現在DMPAを使用しておらず、書面によるインフォームド・コンセントを提出できる健康な非妊娠・非授乳成人（18～39歳）が対象となった。現在またはスクリーニング前の 2 か月間に避妊薬を含む他の研究に登録されていた場合、選択した避妊薬の使用に禁忌があった場合、性器出血（生理間の斑点は含まない）があった場合、検査で陽性反応が出た場合、潜在的な参加者を除外しました。スクリーニング時に HIV または B 型肝炎に感染している、または過去 12 か月以内に DMPA を使用していた。包含/除外基準の完全なリストは、補足表 1S に示されています。

参加者は全員、スクリーニング後に 3 回来院しました。血清、尿、唾液のサンプルを採取する期間は、グループ/避妊法によって異なります (表 1)。グループ A の参加者は、研究会場で 1 錠目、2 錠目、および 3 錠目の錠剤を服用しました。彼らは、最初の投与を受ける前に、1日目と3日目に指定された間隔で血清、尿、および唾液を採取しました。グループBの参加者は、1日目に最初のDMPA注射を受ける前に血清、尿、および唾液のサンプリングを受け、その後再度DMPAを採取しました。 21日目と60日目（±4日）。施設職員は、研究全体を通じて、有害事象 (AE) および重篤な有害事象 (SAE) の発生について参加者を監視しました。参加者からのデータは、すべての研究文書、サンプル、分析、およびその後の計算において匿名化されました。

私たちは、確立された COC の薬物動態 (PK) に基づいて、COC ユーザーから尿と血清のサンプルを収集する時点を選択しました。この薬物動態 (PK) には、毎日のプロゲスチン濃度のピークと谷の濃度が含まれ、錠剤の服用サイクル日の各 24 時間で同じです。排卵を抑制するために摂取されます26。経口投与された LNG の血清濃度のピークは通常、摂取後約 1 ～ 2 時間であり、その代謝物と少量の非代謝 LNG は摂取後約 4 ～ 8 時間で尿中に現れます。したがって、COC摂取後の血清と尿の両方を収集するために6時間の時点を選択し、サンプルを収集するために1日目と3日目を選択しました（表1）。

また、確立された PK データを使用して、DMPA ユーザーの血清および尿の収集時点を選択しました 27。 MPA は DMPA 注射部位から血液中にゆっくりと放出され、排卵抑制 (効果) を達成するレベルが少なくとも 3 か月間維持されます。少量の非代謝 MPA とその代謝産物は、注射後 3 日目から定常状態で尿中に出現し、長期間の治療期間を通じて確実に測定できます。 MPA のピーク濃度は一般に注射後約 3 週間で血清中に見られ、有効性を達成するレベルは少なくとも 3 か月間維持されます。したがって、21日目にDMPAユーザーから血清を収集し、2回目の収集には60日目を選択しました（表1）。

唾液に関しては、LNG および MPA の使用と血清中の濃度に応じた唾液のトランスクリプトームプロファイルへの影響を特定することが目標でした。唾液はホルモンや医薬品などのさまざまな物質の血漿レベルの優れた指標であり、唾液の mRNA は特定の遺伝子が発現したことを示す化学的サインとして機能するため 21、血清の収集に選択したのと同じ時点を使用できると仮定しました。尿を採取して唾液を採取します（表1）。これらの同じ時点を選択する際に、他のステロイドホルモンを調べた研究の結果にも影響を受けました。たとえば、テストステロンの場合、研究者らは経皮投与した場合、唾液、血液、尿中のテストステロン（レベル）が大幅に増加することを確認しました28。

血清瀉血専門医が参加者 1 人あたり 10 mL の血液を採取し、血清処理し、すぐに冷凍し、分析のためにニューヨーク州人口審議会にドライアイスに入れて輸送するまで -20 °C で保管しました。

尿指定された時点で 20 ～ 30 mL の尿を採取するためのサンプリング容器を参加者に提供しました。これらは出荷されるまで -20 °C で保管されました。

唾液施設の職員は参加者に対し、サンプリング前の少なくとも1時間は飲食、喫煙、口腔衛生処置を控え、5分間かけて目盛り付き試験管に唾液を吐き出して約5mLの唾液を採取するよう指示した。 RNA の分解を抑制するために、現場スタッフは唾液を採取する前に採取チューブを氷上に保管しました。サプライヤーの指示 (Norgen Biotek、カリフォルニア州、米国) に従い、現場スタッフは採取直後に安定化試薬を含む保存剤 2 mL を添加し、出荷に備えて採取チューブを -80°C で保管しました。

研究サンプル中のホルモンレベルを測定する前に、FDA ガイドラインに準拠した標準プロトコルを使用して、血清および尿中の LNG および MPA を測定するための LCMS 方法を検証しました。具体的には、ヒト血清中に 0.1 ～ 10 ng/mL の範囲の 6 つの濃度レベルの校正標準 (STD) を添加し、0.3、1、および 7 ng/mL の濃度で 3 レベルの品質管理サンプル (QC) を個別に調製しました。 LNG-d6 または MPA-d6 (5 ng/ml) をそれぞれ内部標準 (IS) として使用し、次のパラメーターを評価および検証しました: 特異性、直線性、定量限界、精度、精度、マトリックス効果、回収率、安定性。私たちの結果は、プロトコルに従ってすべての検証パラメータの許容基準を満たしていることを示しました。

次のステップとして、内部標準としてそれぞれ LNG-d6 または MPA-d6 を使用し、LC-MS/MS によって血清および尿サンプルの両方における LNG および MPA レベルを測定しました。血清試験サンプルから LNG または MPA を精製するために、タンパク質沈殿法を使用しました。具体的には、IS (5 ng/ml) を含む試験サンプル 100 μl にメタノール 100 μl を加えました。サンプルを 15 分間ボルテックスし (14.5 × 103 rpm で 10 分間遠心分離)、上清を注入用の高速液体クロマトグラフィー (HPLC) バイアルに移しました。さらに、同じタンパク質沈殿法を使用して、LNG または MPA 標準および IS を添加した品質管理サンプルを処理しました。

尿サンプルから LNG または MPA を精製するために、Oasis HLB Plus Light カートリッジ (Waters Corporation、マサチューセッツ州ミルフォード) を使用して固相抽出を実行しました。 1 ml のメタノールを使用してカートリッジから LNG または MPA を溶出し、各サンプルを窒素ガス下で乾燥させました。精製した LNG/MPA を 150 µl の移動相 A/B (50/50、v/v) で再構成し、10 µl のアリコートをオートインジェクターアセンブリに注入しました。さらに、同じ固相抽出法を使用して、LNG または MPA 標準、IS を添加した品質管理サンプル、および 1 ml のブランクヒト尿を処理しました。 Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 µm、2.1 × 50 mm) カラムを使用し、80% A (2 mM ギ酸アンモニウム + 0.1% ギ酸酢酸を含む 10% メタノール) からの移動相を使用した勾配溶出によって、他の成分から LNG または MPA を分離しました。 ) および 20% B (100% メタノール) を 0.3 ml/分の流速で最大 6 分間で 90% B にします。次に、Waters TQ-s を使用して、LNG の場合は 313.35 m/z から 245.28 m/z、LNG-d6 IS の場合は 319.38 から 251.32 m/z のプロダクトイオン遷移を監視しました。同様に、MPA では 387.42 m/z から 327.35 m/z への遷移、MPA-d6 IS では 393.40 m/z から 330.34 m/z への遷移を監視しました。 MassLynx ソフトウェアバージョン 4.2 を使用して、LC-MS/MS システムのすべてのパラメーターを制御しました。

研究サンプルの分析では、6 レベルのキャリブレーション標準、1 つのダブルブランク、内部標準を添加した 1 つのマトリックスブランク、および 3 レベルの品質管理サンプルを含めました (n = 2)。品質管理サンプルの 1 セットをサンプルキューの先頭に配置し、もう 1 セットをサンプルキューの最後に配置しました。校正標準はサンプルキューの先頭で注入され、最後のサンプルキューで再注入されました。血清 LNG および MPA の定量下限 (LLOQ) は 0.1 ng/ml、尿 LNG および MPA については 25 pg/ml でした。 50 μl の血清サンプルを血清アッセイの LNG または MPA に使用し、1 ml のヒト尿サンプルを尿アッセイの LNG または MPA に使用しました。品質管理サンプルの結果に基づくと、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は 15% 未満でした。

DetectX LNG EIA 市販キット (Arbor Assays、ミシガン州、米国) を使用して、血清および尿サンプル中の LNG および代謝産物を測定しました。アッセイを検証するために、最初に血清サンプル中の LNG レベルを測定し、LC-MS/MS によって得られた値と比較しました。次に、LC-MS/MS 測定手順で説明したのと同じ固相抽出によって精製された尿サンプル中の LNG レベルの測定を最適化しました。乾燥残留物をアッセイ緩衝液で再構成し、イムノアッセイキット手順を使用して LNG 濃度を測定しました。尿中 LNG 値を pg/mL として報告しました。検出下限は 80 pg/ml でした。

各参加者の唾液から全 RNA を抽出するために、TRIzol® 溶解バッファーを使用し、Nucleospin RNA 抽出キット (Takara Bio, CA, USA, Inc) を使用してその RNA を精製しました。 Qubit Fluorometer (Life Technologies, MA, USA) を使用して RNA 濃度を測定し、バイオアナライザー (Agilent 4200 Tape Station) を使用して RNA の完全性を測定しました。シーケンス反応用の RNA ライブラリーの調製を実施しました。次に、RNA を標識し、Total RNA-Seq キットを使用して配列を決定しました。全長 cDNA の合成と増幅には SMART-Seq v4 Ultra Low Input Kit for Sequencing (Clontech, CA, USA) を使用し、シーケンシングライブラリーの調製には Illumina Nextera XT ライブラリーを使用しました。簡単に説明すると、cDNA を断片化し、トランスポザーゼを使用してアダプターを追加し、続いて制限サイクル PCR を行って cDNA 断片を濃縮し、インデックスを追加しました。最終ライブラリは、Agilent TapeStation を使用して評価されました。サンプルは、2 × 150 ペアエンド (PE) 構成を使用してシーケンスされました。 GENEWIZ, LLC のサービスを利用する (米国ニュージャージー州サウスプレーンフィールド) では、バイオインフォマティクス分析を実施し、HiSeq コントロールソフトウェア (HCS) を適用して画像分析とベースコーリングを実施しました。 Illumina HiSeq から生成された生のシーケンスデータ (.bcl ファイル) を fastq ファイルに変換し、Illumina の bcl2fastq 2.17 ソフトウェアを使用して逆多重化しました。インデックス配列の識別には 1 つの不一致が許容されました。逆多重化後、シーケンスデータの全体的な品質と収量をチェックしました。次に、Trimmomatic v.0.36 を使用してシーケンスリードをトリミングし、アダプター配列の可能性があるものと低品質のヌクレオチドを除去しました。スプライス結合部を検出するスプライスアライナーを使用する STAR アライナー v.2.5.2b を使用して、トリミングされたリードを ENSEMBL で入手可能なホモサピエンス GRCh38 参照ゲノムにマッピングし、スプライス結合部を検出してそれらを組み込んでリード配列全体の位置合わせを支援し、その結果 BAM ファイルが生成されました。次に、特徴カウントを使用して固有の遺伝子ヒットカウントを計算する Subread ソフトウェアパッケージ v.1.5.2 を適用しました。エクソン領域内にあるユニークなリードのみをカウントし、遺伝子ヒットカウントテーブルを使用して下流の差次的発現を分析しました。

研究の主要エンドポイントは、尿中の LNG または MPA 検出の感度と特異度でした。感度は、LC-MS/MS によって検出可能な LNG または MPA を含む尿サンプルの総数を、時点ごとに検出可能な LNG または MPA を含む血清サンプルの数で割ったものとして計算しました。特異度は、検出不能な LNG または MPA を含む尿サンプルの数を、時点ごとに検出不能な LNG または MPA を含む血清サンプルの数で割ったものとして計算しました。また、EIA による尿中 LNG 測定の感度と特異度も計算しました。各感度と特異度の推定値に関する正確な検定に基づいて 95% 信頼区間を計算しました。

探索的エンドポイントとして、ボランティアによる COC の摂取または MPA の注射後の特定の遺伝子の差次的発現の証拠を唾液中で探しました。 DESeq2を使用して、ベースライン（投与前）の遺伝子発現と、COCユーザーとMPAユーザーの両方の唾液サンプルからの投与後の結果を比較しました。 Wald 検定を適用することで、p 値と Log2 倍数変化を生成しました。また、Benjamini-Hochberg 調整臨界値を下回る p 値を持つ遺伝子も特定しました。これらの結果を使用して多重比較を調整し、全体のタイプ 1 誤り率を < 0.05 未満、絶対 log2 倍率変化 > 1 を維持して、各比較の DEG を決定しました。次に、Log2 倍率変化と調整された p 値によって選択された上位 500 遺伝子を使用して火山プロットを生成しました。ソフトウェア GeneSCF v.1.1-p2 を介して、統計的に有意な遺伝子セットに対して遺伝子オントロジー分析を実行しました。私たちは、遺伝子オントロジーアノテーション (GOA) ヒト GO リストを使用して、生物学的プロセスに基づいて一連の遺伝子をクラスター化し、それらの統計的有意性を決定しました。遺伝子オントロジーに基づいてクラスター化された遺伝子のリストを生成しました。

2019年8月から11月にかけて、41人の潜在的な参加者をスクリーニングし、1グループあたり30人、15人を登録しました（図1）。参加者は全員ヒスパニック系、混血、経産婦で、年齢中央値は 29.5 歳でした (表 2)。 30人の参加者全員が2019年12月までに研究を完了したが、早期中止につながる重篤な有害事象や有害事象は発生しなかった。

学習フロー図。コンソート図は、41 人の潜在的参加者がスクリーニングされ、30 人が登録され、そのうちグループ (COC または Depo) ごとに 15 人が登録されたことを示しています。

尿中の LNG の感度/特異性: 図図２ＡおよびＢは、それぞれ１日目および３日目の定量化された血清および尿の値を示している。表 3 は、COC ユーザーからの尿 LNG 測定に対する LC-MS/MS および EIA の感度と特異度の結果を示しています。どちらの方法でも、ベースライン (COC 摂取前) で血清または尿中に LNG が検出可能な個体は存在せず、100% の特異性が観察されました。 COC 摂取後、すべての採取時点ですべての参加者について血清 LNG が検出されました。 LC-MS/MS 分析による尿 LNG の感度は、1 日目では投与 1 の 6 時間後に 80%、3 日目では投与 2 の 24 時間後に 60%、投与 3 の 6 時間後に 93% でした。 EIA による感度はすべての時点で 100% でした。

(A) 血清および尿サンプル中の LCMS/MS 法によって測定されたレボノルゲストレル (LNG) 濃度は、COC 治療の 1 日目と 3 日目に収集されました。ベースライン (Pre) で血清または尿中に検出可能な LNG を示した個体はありませんでしたが、両日 (1 日目と 3 日目) の摂取後 6 時間では全員が増加を示しました。ベースライン後の 3 つの時点すべてで検出可能なレベルを示したのは、参加者 15 人中 8 人だけでした。参加者 6 名はトラフ時点（投与 2 回投与後 24 時間）で LNG レベルが定量レベルを下回っており、そのうち 3 名も初回投与から 6 時間後に検出不能レベルでした。 (B) COC 治療の 1 日目と 3 日目に採取された尿サンプル中の酵素免疫アッセイ (EIA) 法によって測定されたレボノルゲストレル (LNG) 濃度。ベースライン (Pre) で血清または尿中に検出可能な LNG を示した個体はなく、両日 (1 日目と 3 日目) の摂取後のすべての時点で検出可能なレベルを示しました。（C）デポ注射後0日目（ベースライン）、21日目および60日目に収集された血清および尿サンプル中のLC-MS/MS法によって測定されたメドロキシプロゲステロン（MPA）濃度。 4 人は注射前に血清中に検出可能な MPA を有しており、そのうちの 2 人は尿中にも検出可能な MPA を有していました。尿中 MPA は検出できなかったが、血清 MPA は検出できた 2 人の女性は、避妊効果に必要なレベル (< 0.2 ng/mL) を下回っていました。血清 MPA が検出されなかった 1 人は、尿中 MPA が検出可能であり、尿中のレベルは血清閾値レベル (< 0.2 ng/mL) をわずかに上回っていました。注射後 21 日目と 60 日目に、参加者全員の血清と尿から MPA が検出されました。

LC-MS/MS の結果から、すべての参加者が尿中に LNG が検出された時点が少なくとも 1 回あることが示されました。 15 人の参加者のうち 8 人だけが、ベースライン後の 3 つの時点すべてで検出可能なレベルを持っていました (図 2A)。 6 人の参加者はトラフ時点（投与 2 の 24 時間後）で定量レベルを下回る LNG レベルを有しており、そのうちの 3 人も初回投与の 6 時間後に検出不能レベルでした（図 2A）。 1 名を除く参加者全員が、3 回目の投与後 6 時間後に LC-MS/MS により尿中に LNG が検出されました。注目すべきことに、その個人は、最初と二番目の時点の後に尿中 LNG が検出されました。 LCMS/MS および EIA を使用したすべての参加者の実際の LNG レベルを表 2S に示します。

表 4 は、MPA ユーザーの尿および血清サンプル中の MPA の LC-MS/MS 検出を示しています。ベースライン時に血清中に検出不能なMPAを有していた11人の参加者のうち、10人は尿中に検出不能なMPAを有するサンプルを有しており、これは投与前の尿中の特異性91%に相当する。 4 名は注射前に血清中に検出可能な MPA を有しており (図 2C)、そのうち 2 名は尿中にも検出可能な MPA を有していました。血清と尿の両方から MPA が検出された 2 名は、以前の DMPA 注射を否定しました。尿中 MPA は検出できなかったものの、血清 MPA は検出できた 2 人の参加者は、避妊効果に必要なレベル (< 0.2 ng/mL) を下回っていました。彼らは、研究開始の12か月以上前（それぞれ15か月と17か月）にDMPA注射を受けたと報告した。血清 MPA が検出不能な個体は、尿中 MPA が検出可能であり、尿中のレベルは血清閾値レベル (< 0.2 ng/mL) をわずかに上回っていました。注射後 21 日および 60 日後に、すべての参加者の血清および尿から MPA が検出されました (感度 100%)。表 3S では、LC-MS/MS を使用したすべての参加者の実際の MPA レベルを示しています。

DMPAを使用した参加者からの唾液サンプルのRNAシーケンスの分析により、3つの時点でDEGの数が異なることが明らかになりました（表5）。二重クラスタリングヒートマップの情報 (図 3A ～ C) は、21 日目 (D21) および 60 日目 (D60) に取得したサンプルの DEG の視覚的プロファイルを、ベースライン (プレ) サンプルと比較し、並べ替えて相互に比較したものです。調整された p 値によって計算され、log2 変換された発現値でプロットされます。 D21 前と D21 の比較 (3a) では、10 個の異なる発現遺伝子が観察されました。これらの遺伝子のうち 9 つは上方制御され、1 つは下方制御されました。 D60 (3b) より前では、5 つの DEG が見られました。 1 つはダウンレギュレートされ、4 つはアップレギュレートされました。 D21 と D60 の最後の比較 (3c) では、合計 50 個の差次的に発現された遺伝子があり、そのうち 32 個がダウンレギュレートされ、18 個がアップレギュレートされました。倍率変化および調整されたp値に従ったDMPAユーザーの唾液中の遺伝子発現のボルケーノプロットは、異なる時間間隔でのDEGを示しています（図4A〜C）。表 4S には、調整された p 値に標準誤差と信頼区間 (CI) を加えたものによって同定された差次的発現遺伝子をリストしました。 COC ユーザーの唾液サンプルでは、ベースラインと比較して発現差のある遺伝子は検出されませんでした。

(A – C) サンプル中の log2 変換された発現値 (Wald 検定を使用して生成) をプロットすることにより、調整された p 値によって並べ替えられた上位の差次的に発現された遺伝子の視覚的発現プロファイルを示す二重クラスター化ヒートマップ。 (A) は、D21 との比較を示しており、10 個の差次的に発現した遺伝子が観察され、そのうち 9 個が上方制御され、1 つが下方制御されていました。 (B) は、D60 前と D60 の比較を示し、5 つの異なる発現遺伝子が見られました。 1 つはダウンレギュレートされ、4 つはアップレギュレートされました。 (C) は D21 と D60 の最後の比較を示し、合計 50 個の差次的に発現された遺伝子があり、そのうち 32 個がダウンレギュレートされ、18 個がアップレギュレートされました。

(A – C) log2 変換された発現値をプロットすることにより、調整された p 値で並べ替えられた上位の差次的に発現された遺伝子の発現プロファイルを視覚化する火山プロット。下方制御された DEG は赤色で示され、上方制御された DEG は青色で示されます。

この研究は、尿と唾液のサンプル中のバイオマーカーを測定することによって、ホルモン療法の個人的な使用を確認するという避妊の分野における新しい試みを表しています。 COC または DMPA を使用した参加者から採取したサンプルで、LC-MS/MS を使用して尿中の低濃度のネイティブホルモン (LNG または MPA) を測定できることを実証することができました。 LNG の感度は 3 日目の投与後 6 時間で 93% [68 ～ 100%]、MPA の感度は 21 日目と 60 日目で 100% でした。特異性は91%[59-100%]でした。私たちの結果は、ホルモン避妊薬の使用のバイオマーカーを特定するための尿サンプリングの使用に関する発見を確認するための追加研究を進めるための強力な裏付けとなります。私たちは、LNG と MPA の両方について尿中に存在する参照代謝物を合成し、LC-MS/MS によって尿代謝物濃度を測定することを提案します。代謝産物の濃度は、そのままのホルモンよりもはるかに高いと予想されています 29,30,31。したがって、特定の尿代謝産物を測定することで感度と特異性が向上し、ホルモン避妊薬の使用のバイオマーカーとして尿サンプリングを使用するさらなる開発が促進されると確信しています。

私たちの知る限り、私たちの結果は、DetectX キットを使用して尿サンプル中の LNG 濃度を測定できることを実証した最初の結果です。 LC-MS/MS 技術を使用した結果と比較して、EIA によって測定された尿中 LNG 濃度ははるかに高かった。 EIA LNG メソッドは LNG とその代謝物の両方に結合するポリクローナル抗体に基づいているため、この結果は驚くべきことではありません。この EIA 結果が尿中に存在する LNG 代謝産物と DetectX キットで使用されるポリクローナル抗 LNG 抗体との交差反応によるものかどうかを確認し、LNG EIA キットをさらに検証するために特定の参照代謝産物を合成することを提案する必要があります。尿中の LNG と代謝産物を正確に測定します。同様に、参照代謝物は、EIA による尿中の代謝物の測定の感度/特異性を高めるのに役立ちます。これは、LC-MS/MS テクノロジーと比較して、リソースが少ない環境で使用する場合、よりコスト効率が高く、利用しやすい方法となる可能性があります。

私たちの唾液サンプルの調査は、ホルモン避妊薬の使用のバイオマーカーを特定するために唾液が使用できる可能性があるという予備的な証拠を提供します。がん患者から採取した唾液サンプルにおける差次的な遺伝子発現の最近の同定により、さまざまな症状のバイオマーカーとして唾液を探索する道が開かれた 32,33,34 に基づいて、我々は、ホルモン避妊薬の使用により、症状が増加または減少する可能性があると仮説を立てました。 DMPAまたはCOCを使用した個人の一部の選択的遺伝子の制御。ヒートマップに示されているように、ベースラインと比較して、21 日目と 60 日目に DMPA を使用したグループで多数の差次的に発現する遺伝子が見つかりました。その大部分は、さまざまな疾患実体または状態に関連して以前に報告されています。興味深いことに、私たちの研究では、私たちが指摘した変化は、DMPAを使用したときに一部の人が報告する悪影響と一致しているようです。たとえば、一部の DMPA ユーザーの間では体重増加 35 と脱毛症 36 の両方が報告されており、差次的な遺伝子発現の解析により、肥満 35 と PRMT9 (タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ 9) に役割を果たす CRTC (CREB 調節転写コアクチベーター 3) 遺伝子が) 脱毛症を伴う下顎顔面異形成症に関連している遺伝子は両方とも上方制御されていました。さらに、葉酸異化で機能する N-アセチルトランスフェラーゼ 1 が下方制御されていることを確認しました 37,38。この発見は、DMPA使用者は血清葉酸濃度で最も低い四分位（≤ 6.2 ng/mL）にランクされる可能性が高いという疾病管理センターの報告書と一致しています39。また、重要な臨床腫瘍バイオマーカーとみなされている lgals3bp ガレクチン 3 結合タンパク質 40,41,42 が、DMPA ユーザーでは下方制御されていることも確認しました。興味深いことに、DMPA の使用は子宮内膜上皮増殖の劇的な減少を誘導することが報告されており、リンチ症候群患者の化学予防薬としても示唆されています 43。これらの他の症状で同定された差次的に発現する遺伝子のいずれかが、DMPA ユーザーの唾液中のバイオマーカーとしても機能するかどうかを実証するには、さらなる確認研究が必要です。

対照的に、摂取後 24 時間および 72 時間で採取された COC ユーザーの唾液サンプルでは、差次的な遺伝子発現は検出されませんでした。陰性の結果は、COC ユーザーの唾液サンプリングで従った短い時点とシーケンスが原因である可能性があります。おそらく、COC ユーザーの mRNA レベルの変化は、使用後わずか 24 時間および 72 時間では比較的小さかったと思われます。唾液中のホルモンの存在を正確に評価できるかどうかは、ホルモンの生化学的性質と、LNG などのホルモンが口腔に入るメカニズムに依存します 44,45。したがって、COC使用者の24～72時間使用後の検出不能な遺伝子変化は、唾液へのLNGの特異的な輸送機構に関連している可能性があり、これについてはさらに調査する必要がある。

さらに、この研究では、主にコーディング RNA を検出するトータル RNA シーケンスのみを実行しました。最近の研究の結果は、長いノンコーディング RNA とマイクロ RNA がさまざまな機構を通じて相互作用して mRNA を調節できることが実証されました 46。 COCの長期間の使用（および唾液採取時間）や、前例のない感度で数千の小さな非コーディングRNA配列をクエリするマイクロRNA配列決定を適用する将来の研究努力により、COCユーザーで差次的に発現している遺伝子を特定できる可能性があります。

この研究には、いくつかの長所と限界がありました。尿サンプリングを使用してホルモン避妊薬の使用のバイオマーカーを特定できることを実証した我々の結果は、簡単かつ広く適用される尿サンプリングを使用した診断方法の同定に向けた道筋を含む、さらなる開発への準備を整えた。ホルモンレベルの測定に誘導体化技術を利用しなかったという事実は、研究の限界でした。この方法を使用すると、尿サンプル中の低レベルのホルモンの検出が増加し、COC と DMPA の両方の使用を検出する結果の感度が向上した可能性があります。もう1つの制限は、COCまたはDMPAによる治療を開始する前に、ボランティアのベースライン血中LNG/MPAレベルを測定しなかったことです。これらのデータポイントにより、尿サンプルから得られた特異性の結果が改善された可能性があります。

唾液に関する我々の結果に関しては、DMPA ユーザーでの肯定的な結果は、この簡単に入手できる体液を使用して、ホルモン避妊薬の使用のバイオマーカーを特定できる可能性があることを示唆しています。研究のこの段階にのみ RNA シークエンシング技術を使用した場合、COC ユーザーの唾液で異なる発現を示すことができなかった可能性があり、これが研究の弱点でした。さらに、唾液遺伝子発現の変化は累積的である可能性があり、したがって、そのような変化を調査するために使用した短い時間枠は、さらなる弱点を表しました。 COC使用への長期間の曝露が差次的遺伝子発現に及ぼす影響を評価するためにさらなる研究を実施し、COC使用のバイオマーカーを検出するために唾液サンプリングを使用することについてさらなる調査が正当化されるかどうかを判断するための追加情報を得るためにマイクロRNAシークエンシングを適用する必要がある。

全体として、我々の結果によって提起された可能性は、尿または唾液を使用して、公衆衛生研究に適用でき、臨床研究や臨床ケアにも影響を与えるホルモン避妊薬の使用を示す新規バイオマーカーを開発できる可能性があることを示唆しています。

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この研究は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団からの助成金番号OPP1172551（測定とプログラム設計の改善）に基づいて提供された資金によるジョンズ・ホプキンス大学からの補助契約によって支援されました。その内容は著者のみが責任を負うものであり、必ずしもビル＆メリンダ・ゲイツ財団やジョンズ・ホプキンス大学の公式見解を表すものではありません。私たちは、治験のプロトコル開発と医学的モニタリングに関する指導をしていただいた George Creasy 博士に感謝します。リサ・ハダッド博士に、原稿のいくつかの草稿を慎重にレビューして編集していただきました。最終的なフォーマットについては Lorna Begg に問い合わせてください。データ管理支援のために Craig Savel と Divea Venkatasetty に感謝します。研究に参加していただいた 30 名の女性に感謝いたします。

Center for Biomedical Research、Population Council、1230 York Avenue、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

ラキー・サクデヴァ、ナレンダー・クマール、バーバラ・A・フリードランド、マレーナ・プラギアノス、シミン・チャン、ラリサ・キジマ、ルース・B・メルカッツ

プロファミリアクリニック、ニコラスデオヴァンド Esq. Calle 16、Ens. ルペロン、サントドミンゴ、ドミニカ共和国

ヴィヴィアン・ブラーシュ、レイラ・コション、アナ・ソフィア・テハダ・タバール

ゴールドキャニオン、アメリカ

アン・ブラン

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RS は、避妊用バイオマーカーとして唾液を使用する実験を概念化して計画し、唾液サンプルからデータを収集し、尿と血清の EIA および LCMS データを分析し、原稿の技術セクションを執筆/編集しました。 NK は、ホルモン避妊薬の使用のためのバイオマーカーとして尿を使用する実験を概念化および計画し、血清および尿サンプルからの LNG および MPA の結果を監督および管理し、プロトコルの開発に貢献し、原稿の技術セクションを執筆/編集しました。 VB は、臨床現場の主任研究者として採用およびインフォームドコンセント手順を含むデータ収集を実施および監督しました。 BFは研究プロトコールを共同執筆し、研究スタッフを訓練し、適正臨床基準に従って臨床現場の（遠隔）モニタリングを実施し、原稿の執筆/編集に貢献した。 MP は、データ管理および統計分析計画を作成し、すべての臨床現場データをレビューし、血清および尿データの感度および特異性分析を作成および実施し、原稿の執筆/編集に貢献しました。 SZ は、LCMS/MS を使用してすべての COC および MPA サンプルを分析しました。 LK はすべての尿検体に対してすべての EIA 実験を実行しました。 LC は研究現場で研究ボランティアとともに手順を実行し、プロトコールの概要に従ってすべての検体を処理しました。 AST は研究現場で研究ボランティアとともに手順を実行し、プロトコールの概要に従ってすべての検体を処理しました。 AB は、ホルモン避妊薬の使用のためのバイオマーカーの探索を開始し、研究のための資金を確保し、プロトコルの開発に貢献しました。 RBM は研究と研究プロトコルを概念化して共同開発し、プロジェクトの監督を提供し、原稿の大部分を執筆しました。著者全員が最終原稿を確認し、承認しました。

ルース・B・メルカッツとの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Sachdeva、R.、Kumar、N.、Brache、V. 他。ホルモン避妊薬の使用に関するバイオマーカーを開発するための新しいアプローチ。 Sci Rep 13、245 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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受信日: 2021 年 12 月 10 日

受理日: 2022 年 11 月 11 日

公開日: 2023 年 1 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24215-4

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