若年性のミクログリアの枯渇は、マウス V1 における配向性を低下させるが、空間周波数選択性は低下させない

May 28, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 12779 (2022) この記事を引用

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ミクログリアには、出生後の発達中にシナプスの景観を形成する複数のメカニズムが含まれています。しかし、ミクログリアによって媒介されるシナプスの変化が感覚皮質におけるニューロン反応の発達による洗練を反映しているかどうかは、まだよくわかっていない。出生後の生活では、一次視覚野 (V1) におけるニューロン反応の方向性と空間周波数選択性の発達が、高い視力の出現をサポートします。今回我々は、コロニー刺激因子 1 受容体 (CSF1R) 阻害剤 PLX5622 を使用して、配向性と空間周波数選択性の増加が現れる幼若期にマウスのミクログリアを迅速かつ持続的に枯渇させました。マウス V1 の II/III 層における多光子カルシウムイメージングを使用して、興奮性および抑制性の調整特性を同時に測定しました。我々は、ミクログリアの枯渇により一般に誘発活性が増加し、その結果配向選択性が低下することを発見した。驚くべきことに、高空間周波数同調応答の出現にはミクログリアは必要ではなかった。さらに、ミクログリアの枯渇は皮質の両眼視機能を乱さず、正常な深度処理を示唆しています。 V1における方向性と高い空間周波数選択性がミクログリアによって異なってサポートされているという我々の発見は、ミクログリアが選択的ではあるが正常な感覚処理を必要とすることを明らかにする。

複数の感覚系にわたって、経験は、臨界期として知られる可塑性が高まる期間中の神経回路の機能的成熟を導きます1、2、3、4、5。このような幼少期の異常な経験は、大人になっても感覚のコーディングと知覚を混乱させる可能性があります6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。シナプススパインの in vivo 画像研究では、臨界期がスパインの安定性の一時的な変化と一致していることが明らかになりました 16、17、18。重要なことに、臨界期における感覚遮断は、機能的再編成を反映すると考えられるシナプスの構造変化を引き起こす16、17、19、20、21。したがって、シナプス構造を調節する細胞タイプは、感覚回路の機能特性の改良において重要な役割を果たしている可能性があります。

ミクログリアは、青少年と成人の脳回路の形成において複数の役割を果たしています21、22、23。発生中に、ミクログリアはシナプスの除去 24、25、26、27、28、29、スパイン誘導 30、およびトロゴサイトーシス 31 を通じてシナプスの接続を変更することが示されています。成人では、ミクログリアは、Gi 依存性のダイナミクス 32 を通じて、また細胞外 ATP をニューロン活動の強力な抑制剤であるアデノシン 33 に変換することによって、皮質回路活動を抑制します 34。シナプスの修飾や回路活動におけるミクログリアの関与は、ミクログリアが臨界期のメカニズムに関与している可能性を示唆しています。それを裏付けるように、コロニー刺激因子 1 受容体 (CSF1R) の阻害剤を使用してミクログリアを除去すると 35、一次視覚野 (V1) におけるシナプス接続と回路興奮性の両方が増加します 36,37。

視覚系の発達中、両眼の視覚処理の成熟にはミクログリアの機構が関与すると考えられてきました。出生後早期の外側膝状核（LGN）では、網膜の活動により網膜からの過剰な両眼入力が排除され、眼特有の視覚経路の分離が増加します38、39、40、41。ミクログリアによるシナプスの除去は、LGN26、27、28 への網膜入力の彫刻に関与していると考えられています。これらの研究は、視覚回路の解剖学的洗練におけるミクログリアの役割についての強力な証拠を提供しますが、機能については言及していません。最近、補体機構を無効化すると、LGN26 への発達中の網膜入力のミクログリア媒介剪定が防止されることが判明した。興味深いことに、LGN におけるこの解剖学的摂動は、両眼性や V142 の下流の可塑性を乱すことはなく、回路機能を評価することの重要性を強調しています。

両眼視機能を超えて、方位や空間周波数選択性など、高視力をサポートする神経反応の機能的特性の形成におけるミクログリアの役割は評価されていません。視覚系では、方向選択性ニューロンは、伸長された視覚刺激の方向に対して強い選好を示します 1,43,49,50,51。さらに、ニューロンは、繰り返される視覚パターンの特定の空間周波数に応答します 1,43,50,51,52。目が開く前は、V1 ニューロンの配向性と空間周波数選択性が低くなります。開眼後の数週間で、ニューロンは刺激の方向に対する選択性を高め、空間周波数の好みがより微細な刺激の方にシフトします11,53,54,55,56,57。 V1 におけるこれらの調整特性の経験に依存した改良は、視力の知覚限界と強く関連しています 14、45、47、58、59、60。

視覚応答の改良と維持に対するミクログリアの寄与を調べるために、長期ミクログリア枯渇後の V1 LII/III における二光子カルシウムイメージングを実施しました。私たちは、ニューロンの選択性を特徴付けるために、各目を通して複数の方向と空間周波数を調べました 51,61。過剰興奮性が予想され観察された一方で、ミクログリアの枯渇が配向選択性を低下させるだけであることを発見して我々は驚いた。対照的に、我々は、ミクログリアの枯渇にもかかわらず、高空間周波数に同調したニューロンの発達的出現が起こることを発見した。さらに、V1 ニューロンの両眼性はミクログリアの生存に関係なく類似していることがわかりました。これらのデータを総合すると、V1 における高い配向選択性の出現にはミクログリアが特に必要であるという説得力のある証拠が得られます。

成体マウスでは、選択的 CSF1R 阻害剤 PLX5622 (飼料中 1200 ppm) で 3 日間治療すると、成体脳からほとんどのミクログリアが除去されます 62。私たちは、同等の減少率が若年動物でも起こるかどうかを判断したいと考えました。この目的を達成するために、P18 マウスを離乳させ、免疫蛍光染色のために脳を収集するまで対照食または PLX5622 飼料のいずれかを与えました (図 1A)。 IBA1 染色を使用してミクログリアを視覚化したところ (図 1B)、PLX5622 が幼若 V1 からミクログリアの > 99% を迅速に除去することがわかりました (図 1C)。重要なことに、PLX5622食餌を継続すると、成人期まで96%を超えるミクログリア減少が持続した(図1D)。

PLX5622 飼料による若年性ミクログリアの迅速かつ持続的な枯渇。 (A) PLX5622 飼料投与後のミクログリア枯渇の程度を評価するためのタイムライン。 (B) 対照食(上)およびPLX5622(下)食後のIba1について染色したP22脳切片の画像例。 V1 を右に示します。 (C) PLX5622 飼料を与えられたマウスでは、幼若ミクログリアの数が 99% 以上減少します (幼若対照 (マウス 4 匹) = 142.5 ± 12.6 対幼若 PLX5622 (マウス 4 匹) = 1.5 ± 1.2、ウェルシュ t 検定: t = 11.2 、df = 3.1、p = 0.0015)。 (D) PLX5622 治療の継続により、成人ミクログリア数の抑制が維持されます (成人対照 = 161.2 ± 8.9 対成人 PLX6722 = 6.8 ± 2.8、ウェルシュ t 検定: t = 16.6、df = 6.0、p < 0.001)。エラーバーはSEMを表します

開眼後の視力の改善は、V1 調整特性の成熟と同時に起こります 11,47,59,63,64。 V1チューニングの経験依存的な改良におけるミクログリアの役割を決定するために、我々は二光子顕微鏡を使用して、対照の幼若マウスと成体マウス、およびPLX5622を与えられた成体マウスで視覚的に誘発されたカルシウムシグナルを記録しました（図2a）。記録時に、マウスには、7つの空間周波数（0.015〜0.96 cpdの対数間隔）と12の方向（0°〜330°）にわたるドリフト格子で構成される一連の視覚刺激が提示されました（図2b）。刺激はランダム化され、各目に別々に 10 回提示されました。抑制性ニューロンは、小胞性抑制性アミノ酸輸送体（VGAT）を発現する細胞における赤色蛍光タンパク質tdTomatoの発現に基づいて同定されました（図2c）。

ミクログリア枯渇後の配向選択性の低下。 (a) 通常飼育の幼若マウスおよび成体マウス (上)、および P18 から開始して PLX5622 飼料を与えた成体マウス (下) における調整特性の 2 光子イメージングのタイムライン。 (b) ドリフト格子を使用して単一細胞の視覚誘発活動を評価するための実験装置。 (c) AAV-Syn-GCaMP6s を注入した VGAT-tdT トランスジェニックマウス V1 の二光子図の例。（ d ）成人 V1 における対側の眼を介した刺激の提示に対する視覚的に誘発されたカルシウムシグナルの例。 X 軸は格子の方向ごとに構成されています。 y 軸は、格子の空間周波数を増加させることによって構成されます。細い黒い線と太い黒い線は、それぞれ個別のトレースと試行平均トレースを表します。青い線は、ニューロンのピーク空間周波数におけるさまざまな方向への平均応答を表します。この試行平均トレースは、ニューロンの配向調整曲線と配向選択性を生成するために使用されました。 (e) (d) の例のニューロンの方向調整曲線。 (f、g) 個々の調整曲線は、好ましい方向を中心にシフトされ、各動物について平均化されました。 (f) PLX5622 飼料を摂取した少年 (灰色)、成人 (青)、および成人 (赤) の興奮性ニューロンの集団配向調整曲線。 (g) PLX5622 飼料を与えられた少年 (灰色)、成人 (青)、および成人 (赤) における抑制性ニューロンの集団配向調整曲線。興奮性 (h) ニューロンと抑制性 (i) ニューロンの OSI。ヴァイオリンプロットは、幼若マウス (灰色) および成体対照マウス (青)、および PLX5622 を投与した成体マウス (赤) の個体数分布を表します。黒丸は動物の平均 OSI を表します。 (h) 正常な発達中、興奮性ニューロンの OSI は増加します (幼若対照 = 0.48 ± 0.02 vs 成人対照 = 0.57 ± 0.02、p = 0.007)。成人 PLX5622 の OSI (0.50 ± 0.02) は成人対照よりも低く (p = 0.024)、若年対照と同等でした (p = 0.525)。 (i) 正常な発達中、抑制性ニューロンの OSI が増加します (幼若対照 = 0.29 ± 0.02 対成人対照 = 0.36 ± 0.03、p = 0.05)。成体 PLX5622 マウスの OSI (0.33 ± 0.03) は、対照の幼体 (p = 0.294) と成体 (p = 0.330) の中間にありましたが、差異はありませんでした。 nJuvenileControl = 9 マウス、nAdultControl = 9 マウス、nAdultPLX5622 = 11 マウス。エラーバーはSEMを表します

成体 V1 の典型的なニューロンは、方向が反対の少数の漂流格子に強く反応します 43、50、65 (図 2d)。例のニューロンの配向調整曲線は、最も強い応答を引き起こす空間周波数ですべての配向の応答を取得することによって計算されました（図2e）。興奮性ニューロン（図2f）および抑制性ニューロン（図2g）の集団全体にわたる配向選択性を視覚化するために、配向調整曲線をシフトし、優先方向を中心に中心化しました。これらの集団調整曲線の平均は、ほとんどの方向にわたる誘発活動のレベルが、対照の成体（青）よりもPLX5622を与えられた幼体（灰色）およびPLX5622を与えられた成体（赤）の方が高かったことを明らかにしています（図2f、g）。ニューロンの方向選択性を定量化するために、すべての方向での応答を考慮した要約値を提供する方向選択性インデックス (OSI) を計算しました。 OSI が 0 のニューロンは、すべての方向に同じ大きさで応答します。 OSI が 1 のニューロンは、1 つの方向のみに応答します。以前の研究と一致して、興奮性ニューロンOSIは少年期と成人期の間で増加します（図2h）。 PLX5622飼料を与えられた成体マウスのOSIは、成体ではなく幼若マウスのOSIに匹敵しました（図2h）。同様に、PLX5622飼料を与えられたマウスの抑制性ニューロンのOSIは、幼若マウスと異ならなかった（図2i）。

成人の視覚回路における高空間周波数同調ニューロンの出現は、臨界期発達の特徴です。成人の V1 の典型的なニューロンは、中から高の空間周波数の刺激に対して強く選択的です (図 3a)51,64。例のニューロンの空間周波数調整曲線は、優先方向でのすべての空間周波数の応答を取得することによって計算されました (図 3b)。応答の大きさが最も高い空間周波数が、ニューロンのピーク空間周波数であると考えられます。正常な発達中、興奮性ニューロン (図 3c) と抑制性ニューロン (図 3d) の両方で、より高いピーク空間周波数へのシフトが見られます。ミクログリアの枯渇は、両方のニューロン集団におけるより高い空間周波数への発達の移行を妨げませんでした（図3c、d）。

ミクログリアは、V1 における高空間周波数同調の発生や正常な両眼視機能の維持には必要ありません。 (a) 成人 V1 における対側の眼を介した刺激提示に対する視覚的に誘発されたカルシウム信号の例。 X 軸は格子の方向ごとに構成されています。 y 軸は、格子の空間周波数を増加させることによって構成されます。細い黒い線と太い黒い線は、それぞれ個別のトレースと試行平均トレースを表します。 120°の青い線は、ニューロンの優先方向でのさまざまな空間周波数方向に対する平均応答を表します。この試行平均トレースを使用して、このニューロンの空間周波数調整曲線とピーク空間周波数を生成しました。 (b) (a) のニューロン例の空間周波数調整曲線。興奮性 (c) ニューロンと抑制性 (d) ニューロンのピーク空間周波数。ヴァイオリンのプロットは、幼若マウス (灰色) と成体対照マウス (青色)、および PLX5622 飼料を与えられた成体マウス (赤色) の個体数分布を表します。黒丸は動物の平均ピーク空間周波数を表します。 (c) 正常な発達中、興奮性ニューロンはより高い空間周波数に向かってシフトします (幼若対照 = 0.08 ± 0.01 対成人対照 = 0.12 ± 0.01、p = 0.035)。 PLX5622 を与えられたマウスのピーク空間周波数 (0.16 ± 0.02) は、幼若マウス (p = 0.002) よりも高く、成体対照マウス (p = 0.253) に匹敵しました。（ d ）興奮性ニューロンと同様に、抑制性ニューロンは、正常な発達中により高い空間周波数に向かってシフトします（少年対照 = 0.08 ± 0.02 vs 成人対照 = 0.15 ± 0.02、p = 0.043）。 PLX5622 を与えられたマウスのピーク空間周波数 (0.18 ± 0.03) は、幼若マウスよりも高く (p = 0.006)、成体対照マウスと同等でした (p = 0.450)。幼体（灰色）、成体（青色）、およびミクログリア欠損マウス（赤色）における興奮性（e）および抑制性（f）ニューロンの眼優位性指数のヒストグラム。ミクログリアの枯渇は、V1 におけるニューロンの確立された両眼性を変化させませんでした (若年対照 = 0.45 ± 0.08 対成人対照 = 0.30 ± 0.08 cpd、対成人 PLX5622 = 0.36 ± 0.11)。 nJuvenileControl = 9 マウス、nAdultControl = 9 マウス、nAdultPLX5622 = 11 マウス。エラーバーはSEMを表します

臨界期の発達のもう一つの顕著な特徴は、両眼視機能の出現と機能的安定性です。両眼ニューロンは一般に、一方の目を通して示される刺激に対して、もう一方の目を通して示される刺激に対してより強く反応します。この特性は、眼優位指数 (ODI) を使用して定量化できます。 -1 および 1 ODI の値は、それぞれ同側および対側の眼刺激にのみ応答する細胞を表します。すべてのグループにわたって、興奮性ニューロン誘発活動（図3e）は、抑制性の対応物（図3f）よりも両眼性が低くなります（ODIは1に偏っています）。抑制性ニューロンにおける強い両眼性の保存されたパターンは、ミクログリアの枯渇が V1 の両眼処理を混乱させないことを示唆しています。

シナプス接続の再構成は、経験に依存した感覚回路の成熟の根底にあると考えられています21。視覚系では、ミクログリアはシナプスの除去を通じて出生後の接続をサポートしますが 26、27、28、29、ニューロンの調整の発達に対するミクログリアの寄与は不明です。この研究では、CSF1R阻害剤PLX5622を使用してミクログリアを枯渇させることにより、V1発達の臨界期におけるニューロン調整の洗練においてミクログリアがどのような役割を果たしているかに取り組みました。我々は、ミクログリアの除去により誘発活性が上昇し、高い空間周波数選択性と両眼性は維持される一方で方向選択性が低下することが判明した。私たちの観察は、方位選択性をサポートするメカニズムと、高い空間周波数選択性をサポートするメカニズムを分離することを示しています。

我々は、迅速なミクログリア切除における有効性が十分に立証されているため、CSF1R 阻害剤 PLX5622 を使用することを選択しました 66、67、68、69。このパラダイムの薬理学的性質により、体内の他の CSF1R 発現細胞の CSF1R シグナル伝達は変化しますが、ミクログリアと脳マクロファージは生存のために CSF1R シグナル伝達に独自に依存しているようであり 70、そのため他の骨髄細胞集団の完全な排除は起こりません。ミクログリアを除去するための遺伝的アプローチも開発されており、TMEM11971 や Hexb72 など、他の骨髄集団よりもミクログリアを選択的に標的にすることができるいくつかの Cre ドライバー株が開発されました。これらの系統と Cre 依存性ジフテリア毒素発現マウスを組み合わせると、ミクログリア集団は急速に死滅しますが、サイトカインストームが発生し、生き残った細胞から急速に再集団が発生します 73、74、75。ミクログリアを枯渇させるCSF1R阻害剤治療では、サイトカインストームも再増殖も起こらない70。 CSF1R阻害剤はミクログリア枯渇に対する現在の最良のアプローチである一方で、脳全体のミクログリアの除去をもたらすことに留意すべきである35。したがって、V1 での観察がミクログリアの局所的喪失によるものであると結論付けることはできません。さらに、我々の研究は、高い V1 方向選択性をサポートする他の骨髄細胞の役割を除外することはできません。 Cre 依存性の分泌型 CSF1R 阻害タンパク質 76 と、ニューロン特異的プロモーター 77 および血清型 78 による AAV-Cre の局所送達との組み合わせは、V1 におけるミクログリアの持続的な局所的枯渇が我々の結果を再現するかどうかをテストするのに有用であることが判明する可能性がある。

我々のデータは、配向選択性を高める上でミクログリアが選択的かつ必要な役割を果たしていることを示唆している。 1つの説明は、ミクログリアが抑制性ニューロンのように機能し、興奮性の閾値を増加させることで皮質の調整を形成し、その結果、興奮性スパイク出力をより選択的にするというものです56,79。したがって、ミクログリアが存在しない場合、ニューロンはより興奮しやすくなり、非優先刺激に対する応答性が効果的に増加し、方向選択性が低下する可能性があります。実際、アンジェルマン症候群のマウスモデルでは、内因性ニューロンの興奮性の増加は、V180 における方向選択性の低下と同時に発生します。興奮性メカニズムの裏付けとして、V1 における興奮性およびパルブアルブミン (PV) 抑制性ニューロンの自発的シナプス伝達は、ミクログリア枯渇後に増加することが示されています 36,37。したがって、回路全体の興奮性を調節するミクログリアのメカニズムは、調整特性の発達上の洗練に貢献している可能性があります。

方位と空間周波数の選択性は、時間と空間にわたってほぼ分離可能です81、82、83。さらに、一部のシナプス分子は、選択された皮質応答特性の改良に必要であることが最近判明しました59、84、85、86。したがって、ミクログリアが特定の調整特性を持つシナプスを認識し、変更する可能性があります。実際、発達中の網膜形成系では、ニューロン上の活動に関連する分子マーカーがミクログリアにどのシナプスを除去するかを指示します24、26、27。したがって、方向選択性の改良にはミクログリアが選択的に必要であるという我々の発見は、調整特性に関連する固有のシナプスタグを認識するミクログリアの能力を反映している可能性がある。

ニューロンとは対照的に、ミクログリアは小さく、運動プロセスの重複がほとんどなく脳をタイル状に並べています。したがって、タイリングの密度は、ミクログリアが示差的なシナプス除去に関与できる空間スケールを設定する可能性があります。少なくとも方向の選択性に関しては、個々のニューロンへのシナプス入力の優先度は、その全体的な方向の優先度を弱くしか予測しないことが確立されています 87,88。最近、親ニューロンと同様の配向優先性を持つシナプスが時間的に密に相関しており、樹状突起に沿ってクラスターを形成していることが判明しました 89,90,91。機能的に類似したシナプスのクラスター化により、活動のホットスポットが形成され、ミクログリアを介したシナプスの除去と誘導が異なって行われる可能性があります。樹状突起に沿ったシナプスの両眼性と空間周波数選択性がより均一に分布している場合、ミクログリアはそれらの調整特性の全体的な分布に偏りがない方法で関与している可能性があります。感覚回路発達におけるミクログリアの役割をより深く理解するために、今後の研究では、ミクログリアの接触と樹状突起全体にわたるシナプス調整特性の分布との関係を調査する必要がある。

私たちの知る限り、この研究は、V1層II/III GABA作動性ニューロン集団における調整の発達の洗練を測定した最初の研究です。他の研究者らの意見と同様に、成人の抑制性ニューロンは興奮性ニューロンよりも刺激の方向に対する選択性が低いことがわかりました 50,92,93。私たちの分析では、阻害の種類ごとに分けていませんでした。これまでの発生研究では、パルブアルブミン阻害性 (PV) ニューロンの配向選択性が幼若期の発育中に低下することが示されています 56,94,95。ここでは、抑制性集団が刺激の方向に対してより選択的になることを示します。これは、PV ニューロンの機能発達における、他の主要な抑制性ニューロンクラスであるソマトスタチン発現 (SST) 細胞からの相違を反映している可能性があります 96、97、98。実際、成体 V1 の SST 細胞は、興奮性ニューロンに匹敵する配向選択性を示します 99。未熟な SST ニューロンの配向選択性が低下している場合、我々が観察した II/III 層の抑制性ニューロンの配向選択性の発達の増加は、SST の発達によって引き起こされている可能性があります。今後の研究により、皮質細胞のさまざまなサブタイプに対するミクログリア枯渇のより具体的な影響が明らかになる可能性があります。

私たちの観察は V1 に限定されていましたが、方向選択性の成熟に対するミクログリアの枯渇の影響は他の視覚回路にも及ぶ可能性があります。高い方向選択性は主に一次視覚経路の V1 で現れますが、膝関節外視覚経路の上丘 (SC) ニューロンは刺激方向に対して弱い選択性を示します 100。 SC は、空間的に誘導された指向性の反応に不可欠な視覚回路です 101,102。重要なのは、異なる SC 細胞タイプ 103 が捕食者回避行動 104 と獲物捕獲行動 105 をサポートしていることです。ミクログリアが視覚回路全体の方向選択性をサポートしている場合、ミクログリアの枯渇によりSC内の方向選択性が混乱し、被食者-捕食者の行動が混乱する可能性があります。

現在まで、ミクログリアのシナプス除去と神経回路機能との関係は、回路活動の広範な変化に限定されている。重要なことに、この研究まで、通常の視覚体験中のニューロン調整の発達におけるミクログリアの役割は直接評価されていませんでした。今回我々は、幼体の発育段階からミクログリアが除去されると、回路機能に選択的かつ永続的な影響を与えることを発見した。ミクログリアが枯渇した V1 では高空間周波数に同調したニューロンが出現しますが、配向選択性の鈍化だけで動物の視力が損なわれる可能性があります。私たちの研究は、出生後の感覚系の発達におけるミクログリアの重要な役割について説得力のある証拠を提供し、出生後の臨界期におけるミクログリア欠損が感覚処理における微妙ではあるが長期にわたる欠損を引き起こす可能性があることを示唆しています。

抑制性ニューロンを視覚化するために、Cre 依存性 tdTomato レポーター (Ai14、JAX 007914) を保有するマウスと、小胞 GABA トランスポーター (VGAT) プロモーター (VGAT-ires-Cre106、JAX 028862) の制御下で Cre リコンビナーゼを発現するマウスを交配しました。マウスを明/暗サイクル(12/12時間)に保った。すべての実験は明周期中に行われ、雄と雌の両方のマウスを使用しました。すべての実験プロトコルと手順は、カリフォルニア大学アーバイン校の動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認され、そのガイドラインに従っています。この研究はARRIVEガイドラインに従って報告されています。

ＰＬＸ５６２２は、ＰｌｅｘｘｉｋｏｎＩｎｃ．によって提供され、ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓＩｎｃ．によってＡＩＮ－７６Ａ標準飼料中に１２００ｍｇ／ｋｇで配合された。すべてのマウスは P18 で離乳され、同腹子は 2 つのグループに分けられました: (1) PLX5622 の餌、および (2) 対照の餌。摂食を促進するために、生後 4 週間までマウス 1 匹につき 1 日あたり 1 ペレットを投与しました。これは、餌ホッパーに到達するのが難しい離乳したばかりのマウスにとって特に重要でした。

マウスは、O2 中のイソフルラン (Patterson Veterinary) で麻酔されました (導入には 2%、維持には 1 ～ 1.5%)。周術期の鎮痛を提供するために、カルプロフェン注射剤(10 mg/kg sc、Zoetis)を投与した。体液損失を補うために乳酸リンゲル液（0.5 mL/20 g/h、皮下注射）を投与した。眼は滅菌眼軟膏（ミシガン州リヴォニアのラグビー）で脱水から保護された。すべての手術器具は、高温ガラスビーズ滅菌器 (Germinator 500) を使用して滅菌されました。マウスは、通常の食事と毛づくろいの行動が再開されるまで、ホームケージ内で温かい加熱パッドの上で回復しました。術後のケアは、ヘッドプレート移植後少なくとも 2 日間、および頭蓋窓手術後の 5 日間、毎日のカルプロフェン注射で構成されていました。

脱毛およびポビドンヨードによる滅菌後、頭皮を局所用 2% リドカイン塩酸塩ゼリー (Akorn) で少なくとも 5 分間覆いました。頭皮およびその下にある結合組織を除去して、頭頂骨および頭頂間骨を露出させた。塩酸リドカイン (1%) を右側頭筋に注射し、その後、頭蓋骨から (後半部分) を取り外しました。頭蓋骨をエタノール(脱イオン水中70%)を使用して乾燥させ、組織接着剤Vetbond(3M)の薄層を塗布した。カスタム印刷されたチタン製ヘッドプレート (Star Rapid) を、アクリル樹脂 Ortho-Jet BCA (Lang Dental) を使用して頭蓋骨に取り付けました。

ニューロンの活動をモニタリングするために、ニューロン特異的プロモーター Synapsin77 (1 × 1012 GC/mL) の下で遺伝的にコードされたカルシウム指標 GCaMP6s (Penn Vector Core) を使用しました。若年期の記録では、新生児 (P2 ～ 5) に氷麻酔をかけ、面取りガラス製マイクロピペット (先端直径約 100 μm) を副鼻腔合流点の側方約 3.5 mm、前方約 1 mm に垂直に下げました。マイクロピペットを皮質の表面から約 700 µm の深さまで急速に前進させ、油圧マニピュレーター (Narishige、MO-10) を使用してウイルスを注射しました (200 ～ 400 nL、200 nL/分)。その後の網膜位マップ (「固有シグナル光学イメージング」セクションを参照) を使用して、ウイルスが両眼 V1 に注入されたことを確認しました。成人の記録では、ヘッドプレート移植後 1 週間以内に網膜局所マップによって V1 へのウイルス送達が誘導されました。硬膜の小領域が露出するまで、中心 bV1 上にバーホールを作成しました。マイクロピペットが貫通する前に脳を押し下げることによる血管の破裂や組織損傷を防ぐために、注射器の先端を使用して硬膜に傷を付けた。ウイルスを硬膜下の深さ 350 μm に 6.66 nL/min で注入しました。脳血管破裂のあるマウスはこの研究には使用されませんでした。我々は、バリ穴上の複数の薄いヴェットボンド層（キムワイプですぐに除去）が頭蓋骨を保護し、3〜4週間後に行われた頭蓋窓手術中に頭蓋骨を除去した後に認められたような目に見える損傷を引き起こさないことを発見しました。

カルプロフェンに加えて、脳浮腫を防ぐためにマウスにデキサメタゾン (5 mg/kg、皮下注射) を 1 回注射しました。小さな開頭術 (3 mm) が V1 の中心にありました。さらに 1 mm 外側の頭蓋骨領域を薄くして、4 mm のガラス製カバーガラス (World Precision Instruments、フロリダ州サラソタ) を露出した脳の上に置き、開頭術周囲の薄くなった骨に押し付けます。頭蓋骨除去後の硬膜からの出血を吸収するために、滅菌生理食塩水に予め浸したGELFOAM滅菌スポンジ(Patterson Veterinary)を使用した。ガラスを鉗子を使用して手動で押さえ、その端を最初にヴェットボンドの薄い層で、次にアクリル樹脂で頭蓋骨に貼り付けた。実質に手術または術後の出血があるマウスは使用しませんでした。一部のマウスでは術後に軽度の硬膜出血が見られました。 3 日以内に完全に消えなかった硬膜出血は、通常、骨の成長と画像の鮮明さの低下につながります。したがって、術後の出血が 3 日以内に消えなかった場合、マウスは安楽死させられました。

すべての記録は、覚醒したマウスの頭を滑らかなタブレット表面に固定して行われました。すべての刺激は、マウスの目から 25 cm 離れたガンマ補正された 24 インチ LED モニター (Asus VG248、60 Hz リフレッシュレート、20 cd/m2) 上に提示されました。

Andor Zyla sCMOS (30fps) を搭載した SciMedia THT マクロスコープ (Leica PlanApo 1.0 ×、6.5 × 6.5 mm イメージング領域) を使用して血行力学的反応をイメージングしました。照明にはLEDドライバー(DC4104 当社)を使用しました。まず、緑色光 (530 nm) を使用して表面血管構造の参照画像を取得しました。次に、カメラの焦点を頭蓋骨表面の下約 600 μm に合わせました。赤色フィルターを経路に挿入し、赤色光 (617 nm) を使用して V1 を均一に照射しました。すべての実験で提示された刺激は、マウスの視野の中心 30°に広がり、20 秒ごとに定期的にコントラスト変調された掃引ノイズ刺激で構成されていました。各記録トライアルは、0° および 180° での 10 回のプレゼンテーションで構成されました。刺激は、カスタム Python スクリプトを使用して、帯域制限 (< 0.15 cpd、< 4 Hz) の 2 値化時空間ノイズムービーに 1 次元ガウス空間マスク (20°) を乗算することによって生成されました。

カルシウムシグナルは、Nikon 16× (NA = 0.8) 水浸対物レンズを備えた共鳴二光子顕微鏡 (Neurolabware) を使用して検出されました。 900 ～ 920 nm に調整した Ti:Sapphire レーザー (Mai Tai HP、Spectra-Physics) を使用して、赤色 (tdTomato) および緑色 (GCaMP6s) の蛍光を刺激しました。データ収集 (10 Hz、髄膜下 200 ～ 300 μm) は、Scanbox ソフトウェア (Neurolabware) によって制御されました。視覚刺激はカスタム Python ソフトウェアによって生成されました。刺激は、ブランク (均一な輝度) 条件、全フィールドフリッカー (3 Hz) 条件、および 6 ～ 7 の空間周波数 (0.015 ～ 0.96、対数間隔) の全フィールドドリフト正弦波格子 (コントラスト 100%) で構成され、 12 方向 (0° ～ 330°、30° ステップ)、3 Hz。各条件は、1.5 秒の視覚刺激とそれに続く 1.5 秒の均一な灰色の画面で構成されました。各記録は 10 回の試行で構成され、各試行はランダム化された条件で構成されていました。刺激は、オクルードを使用して一度に片目に提示されました。オクルージョンの順序はセッションごとにランダムに選択されました。

マウスを最初に1XPBSで経心的に灌流し、次に固定剤(1xPBS中4% PFA)で灌流した。脳を抽出し、後固定し、30% スクロース中で凍結保存しました。凍結ミクロトームを使用して、脳を厚さ 50 μm の切片にスライスしました。蛍光免疫標識は、以前に記載されている標準的な間接技術に従いました62。簡単に説明すると、浮遊切片を、0.2% Triton X100 (Sigma-Aldrich) および 5% ヤギ血清 (Sigma-Aldrich) を補充した PBS でブロックし、その後、初代培養物と 4 °C で一晩インキュベートしました。脳切片を、イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (IBA1) (1:1000; カタログ番号 019-19741、Wako) に対する一次抗体で染色しました。高解像度の蛍光画像は、Leica TCS SPE-II 共焦点顕微鏡と LAS-X ソフトウェアを使用して取得しました。共焦点イメージングでは、特に指示がない限り、マウスごとに脳領域ごとに 3 つの視野 (FOV) をキャプチャしました。総細胞数とスポット分析は、各動物の同等の組織切片を 20 倍または 63 倍の対物レンズ、複数の Z 平面でイメージングし、その後 Bitplane Imaris 7.5 スポットを使用して自動分析することによって得られました。

皮質応答の振幅マップは、カスタム MATLAB (MathWorks) ソフトウェアを使用して、刺激繰り返しの周波数でフーリエ解析 107 により抽出されました。これらのマップは、bV1 へのウイルス注入をガイドするために使用されました。

カスタムで作成された Matlab および Python コードを使用して、モーションアーティファクトの除去、細胞 ROI の配置、カルシウムシグナルの抽出、および前述の分析の実行が行われました 51。簡単に言うと、フーリエ変換アプローチを使用してフレームとテンプレート画像の間のユークリッド距離を最小限に抑えることによって並進アーティファクトを補正する効率的なアルゴリズムを使用して記録を登録しました。まず、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンに対して ROI を手動で配置しました。時間 t における体細胞カルシウムシグナルは、Fsoma(t) = Fsoma(t) − (R × Fneuropil(t)) として決定されました88,93。血管内の GCaMP6s シグナルの強度を隣接するニューロパイルの強度と比較することにより、R は経験的に 0.8 であると決定されました。各細胞のニューロピル信号 Fneuropil(t) は、細胞の外側および細胞中心から約 40 μm の領域内のすべてのピクセルの信号を平均することによって測定されました。

各条件に対する細胞の応答を決定するために、視覚刺激中の ROI の平均カルシウムトレースを、前の灰色画面の最後の 0.5 秒間の平均カルシウムシグナルに対して正規化しました。特定の方向 θi に対する応答は、10 回の試行にわたる平均応答 F(θi) として定義されました。ニューロンの調整を評価するために、次の 2 つの基準を満たすニューロンに分析を限定しました。まず、各空間周波数で、ブランク条件に対する方向間の一元配置分散分析 (p < 0.01) を使用して応答性を決定しました。第二に、最も強い誘発反応は、ブランク刺激を使用して決定される非誘発カルシウムノイズよりも高くなければなりませんでした:meanblank + (2xSDblank)。細胞の応答性は、それぞれの目について個別に測定されました。

ピーク空間周波数は、最も強いカルシウム応答 (Rmax) を誘発する条件の空間周波数として決定されました。統計分析では、最も強い誘発反応を示す目のピーク空間周波数のみが使用されました。集団の空間周波数調整曲線は、最初に各動物について計算され、次に 2 つの方法ですべてのマウスの平均がとられました。最初の方法では、空間周波数調整曲線はピーク空間周波数を中心として平均化されました。 2 番目の方法では、空間周波数調整曲線をシフトせずに平均化しました。

優先方位 (θpref) は、次のように各方位での応答 F(θ) によって重み付けされた方向ベクトルの平均の半分を計算することにより、ピーク空間周波数に沿って計算されました。

配向選択性は、次のような円分散に基づく方法を使用して、ピーク空間周波数で計算されました。

OSI 値が 0 未満および 1 を超える細胞は分析から除外されました。統計分析では、誘発反応が最も強い目の方向選択性のみが使用されました。各マウスについて、最も強い応答を引き出す方向を中心に調整曲線を配置することによって、集団方向調整曲線を計算しました。集団調整曲線はすべてのマウスで平均されました。

眼優位指数は次のように計算されました。

ここで、C と I はそれぞれ、対側と同側の最も強い反応です。 ODI が -1 の場合は、同側の目からの刺激にのみ反応する細胞を示します。 ODI 1 は、対側の目からの刺激にのみ反応する細胞を示します。単眼刺激にのみ反応するニューロンの場合、反応する眼を通るピーク空間周波数を使用して、反応しない眼から最も強いカルシウム信号を抽出しました。

図 1 の Welsch t 検定には GraphPad Prism (GraphPad Software v9) が使用され、図 1 と図 2 ではベンジャミニ、クリーガー、およびイェクティエリの 2 段階設定法を使用して偽発見率を制御する一元配置分散分析が使用されました。。カスタム Python ルーチンは、図 2 および 3 の視覚応答性および関連する選択性計算の一元配置分散分析テストに使用されました。データのプロットは、Matlab スクリプトと GraphPad Prism を使用して実行されました。

データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27362-w

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ダリオ X フィゲロアベレス

カリフォルニア大学神経生物学および行動学科、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

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学習と記憶の神経生物学センター、カリフォルニア大学アーバイン、アーバイン、カリフォルニア州、92697、米国

キム・グリーン & スニール・P・ガンジー

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DXFV は NIH F31 (EY028046) によってサポートされました。 DXFV、MA、CYLH は SPG および KNGDXFV の監督の下で実験・解析を実施し、SPG が原稿を執筆しました。

スニル・P・ガンジーへの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ベレス、DXF、アレオラ、M.、ヒュー、CYL 他若年性のミクログリアの枯渇は、マウス V1 における配向性を低下させますが、高い空間周波数選択性を低下させません。 Sci Rep 12、12779 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-15503-0

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受信日: 2022 年 2 月 24 日

受理日: 2022 年 6 月 24 日

公開日: 2022 年 7 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15503-0

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