SARSに感染したアカゲザルにおけるレムデシビルの臨床的利点

Aug 11, 2023

Nature volume 585、page 273–276 (2020)この記事を引用

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メトリクスの詳細

2019年コロナウイルス感染症（COVID-19）を治療するための効果的な治療法が緊急に必要とされています。多くの治験薬、承認薬、再利用薬が潜在的な治療法として提案されていますが、動物モデルから得られた前臨床データは、生体内で有効性のない治療薬を除外することで、効果的な治療法の探索を導くことができます。レムデシビル (GS-5734) は、広範な抗ウイルス活性を持つヌクレオチド類似体プロドラッグ 1,2 であり、現在、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の臨床試験で研究されており、最近米国食品医薬品局から緊急使用許可を取得しました 3,4 。動物モデルでは、レムデシビルは中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）の感染に対して有効でした2,5,6。 in vitroでは、レムデシビルはSARS-CoV-27,8の複製を阻害した。今回我々は、SARS-CoV-2感染のアカゲザルモデルにおけるレムデシビルの有効性を調査する9。溶媒で治療した動物とは異なり、レムデシビルで治療したマカクザルは呼吸器疾患の兆候を示さなかった。彼らはまた、初回投与から12時間後のX線写真で肺浸潤の減少と気管支肺胞洗浄液でのウイルス力価の減少を示した。上気道からのウイルス排出は、レムデシビル治療によって減少しませんでした。剖検では、レムデシビル治療を受けた動物では肺のウイルス量が減少し、肺の損傷が軽減されていました。したがって、感染中の早期に開始されたレムデシビルによる治療は、SARS-CoV-2に感染したアカゲザルにおいて臨床的利点があった。アカゲザルモデルは、一部の新型コロナウイルス感染症患者で観察される重篤な疾患を表すものではありませんが、我々のデータは、肺炎への進行を防ぐため、新型コロナウイルス感染症患者におけるレムデシビル治療の早期開始を裏付けています。

私たちは最近、SARS-CoV-2 感染のアカゲザルモデルを確立しました9。このモデルでは、感染したアカゲザルは軽度から中等度の一過性の呼吸器疾患を発症し、X線写真で肺浸潤が確認でき、新型コロナウイルス感染症患者で観察されるものと同様の脱落パターンが見られる。観察された臨床徴候と高いウイルス量により、このモデルで直接作用する抗ウイルス薬の治療効果をテストすることが可能になります。

6匹のアカゲザルからなる2つのグループにSARS-CoV-2株nCoV-WA1-2020を接種した。接種の12時間後、一方のグループには10 mg kg-1のレムデシビルを静脈内投与し、もう一方のグループには等量のビヒクル溶液（2 ml kg-1）を投与した。最初の治療から 12 時間後、その後 24 時間ごとに 5 mg kg-1 の用量のレムデシビルまたは等量のビヒクル溶液 (1 ml kg-1) で治療を継続しました。レムデシビルの濃度は、最初の治療の 12 時間後およびその後の投与の 24 時間後 (次の治療量が投与される直前) に採取された血清で測定されました。レムデシビル（プロドラッグ GS-5734）、その下流アラニン代謝物（GS-704277）、および親ヌクレオシド（GS-441524）が、レムデシビルで治療したすべての動物の血清中に検出されました（拡張データ図 1a）。プロドラッグおよび下流代謝物の血清レベルは、以前に公表された健康なアカゲザルにおけるこれらの化合物の血漿レベルと一致しており、GS-5734 の全身半減期が短い (0.39 時間) ため、中間体 GS-704277 および中間体 GS-704277 への一時的な変換が示されました。より高い血漿レベルでの下流の GS-441524 製品の持続性 10.

代謝産物 GS-441524 の濃度は、接種後 7 日 (dpi) およびレムデシビルの最後の投与から 24 時間後に各肺葉から採取された肺組織で測定されました。この代謝産物は、レムデシビルで治療したすべての動物で容易に検出できました。 GS-441524 は通常、肺の 6 つの葉すべてに分布していました (拡張データ図 1b)。 GS-704277 は肺組織では検出されませんでした。レムデシビルの薬理学的に活性な代謝物はGS-441524の三リン酸塩ですが、三リン酸代謝物を添加した肺ホモジネートサンプルは、このマトリックス中で代謝物の急速な減衰を示しました（データは示されていません）。 GS-441524 レベルは組織負荷の代用として取得され、現在の投与戦略が感染動物の SARS-CoV-2 複製部位に薬物代謝物を送達したことを示唆しています。

SARS-CoV-2の接種後、動物には、事前に確立されたスコアシートに基づいて盲検法で毎日の臨床スコアが割り当てられました。レムデシビルの最初の投与から 12 時間後、レムデシビルで治療した動物の臨床スコアは、ビヒクル溶液を投与した対照動物よりも有意に低かった。この臨床スコアの差は研究全体を通じて維持されました（図 1a）。レムデシビルで治療した 6 匹の動物のうち 1 匹だけが軽度の呼吸困難を示しましたが、ビヒクルで治療したすべての対照では頻呼吸と呼吸困難が観察されました (拡張データ表 1)。 X線撮影による肺浸潤は、ヒトにおける新型コロナウイルス感染症の特徴の1つです。 0、1、3、5、および 7 dpi で撮影された X 線写真では、レムデシビルで治療された動物では、ビヒクルで治療された動物よりも肺葉の関与が有意に少なく、肺浸潤がそれほど重篤ではないことが示されました（図 1b、c）。

a、SARS-CoV-2に感染し、レムデシビル（赤丸、n = 6）またはビヒクル溶液（黒四角、n = 6）で治療された動物の毎日の臨床スコア。 b、累積放射線写真スコア。腹背側および側面の X 線写真は、標準スコアリングシステムに従って臨床獣医師によって肺浸潤の存在についてスコア付けされました (0、正常、1、軽度の間質性肺浸潤、2、おそらく部分的な心臓境界の消失と肺の小さな領域を伴う中等度の肺浸潤)。硬化; 3、重度の間質浸潤、広範囲の肺硬化、肺胞パターンおよび気管支造影）。個々の葉をスコア化し、動物ごとの 1 日あたりのスコアを合計して表示しました。 c、7 dpiで撮影された各動物の腹背部のX線写真。肺浸潤の領域は丸で囲まれています。統計分析は、Sidak の多重比較検定を使用した二元配置分散分析を使用して実行されました。

1、3、および 7 dpi で、下気道におけるウイルス複製の指標として気管支肺胞洗浄 (BAL) を実行しました。レムデシビルで治療した動物ではBALのウイルス量が減少しましたが、この差は統計的に有意ではありませんでした（図2a）。しかし、最初のレムデシビル治療が施されてから 12 時間後、BAL における感染ウイルス力価は、レムデシビル治療動物では対照動物よりも約 100 倍低かった。 3 dpiまでに、レムデシビル処置動物のBALでは感染性ウイルスは検出されなくなりましたが、6匹の対照動物のうち4匹のBALではウイルスが依然として検出されました（図2b）。このように下気道におけるウイルス複製が減少したにもかかわらず、レムデシビル投与動物から採取した鼻、喉、または直腸のスワブでは、ウイルス量や感染性ウイルス力価の減少はありませんでした。 1 dpi および 4 dpi で収集された喉スワブのウイルス量 (拡張データ図 2)。

a、b、SARS-CoV-2に感染し、レムデシビル（n = 6）またはビヒクル溶液（n = 6）で処理されたアカゲザルから収集されたウイルス量（a）およびBAL中の感染ウイルス力価（b）。 TCID50、50% 組織培養感染量。統計分析は、Sidak の多重比較検定を使用した二元配置分散分析を使用して実行されました。 c、SARS-CoV-2に感染し、レムデシビル（n = 6）またはビヒクル溶液（n = 6）で処理したアカゲザルの7 dpiの剖検で6つの肺葉すべてから収集された組織内のウイルス量。統計分析は、対応のない t 検定を使用して実行されました。センターバー、中央値。

すべての動物は 7 dpi で安楽死させました。組織サンプルを各肺葉から採取し、レムデシビル処置動物とビヒクル処置動物の間でのウイルス複製を比較した。レムデシビル投与動物から採取した肺葉サンプル 36 個のうち 10 個ではウイルス RNA が検出できませんでしたが、対照動物から採取した肺葉サンプル 36 個のうち 3 個のみでウイルス RNA が検出されました。一般に、2 つのグループの個々の肺葉にわたる比較では、レムデシビル治療グループの方がウイルス RNA の幾何平均が低いことが示されました (拡張データ図 3a)。まとめると、これらのデータは、レムデシビルで治療した動物の肺では、ビヒクルで治療した対照の肺よりもウイルス量が有意に低かったことを示しています（図2c）。ビヒクル処置対照動物６匹のうち５匹の肺葉からウイルスを分離できたが、レムデシビル処置動物から採取した肺組織のいずれからもウイルスを分離できなかった。逆転写を伴う定量的PCR（qRT-PCR）では、レムデシビル治療動物ではコントロールよりも気道の他の位置のウイルスRNA陽性組織が少ないことが示されましたが、これらの違いは統計的に有意ではありませんでした（拡張データ図3b）。

7 dpi の剖検で、肺の病変を肉眼的に評価しました。レムデシビル治療を受けた動物 6 匹中 1 匹で肉眼的肺病変が観察されました。対照的に、ビヒクルで治療した対照動物6頭すべてには目に見える病変があり、その結果、病変の影響を受けた肺の面積に統計的に有意な差が生じました（図3a、b、拡張データ図4a、b）。この違いは、肺炎の指標として肺重量対体重比を計算した場合にも明らかでした。この比率は、ビヒクルで治療した動物よりもレムデシビルで治療した動物の方が有意に低かった(拡張データ図4c)。組織学的には、レムデシビルで治療した動物の病変は、ビヒクルで治療した対照動物に比べて少なく、より軽度でした。レムデシビル治療を受けた動物6匹中3匹には肺の組織学的病変が見られなかった。残りの 3 頭の動物には最小限の肺病変が発生しました。これらの動物の病変は、胸膜下腔に頻繁に位置する、広く離れた最小限の間質性肺炎として特徴付けられました（図3c、e）。ビヒクル処置動物６匹中５匹は、多巣性の軽度から中等度の間質性肺炎を発症した（図３ｄ、ｆ）。治療に関係なく、すべての動物の少数のI型およびII型肺細胞および肺胞マクロファージでウイルス抗原が検出されました（図3g、h）。

SARS-CoV-2に感染し、レムデシビル（左、n = 6）またはビヒクル溶液（右、n = 6）で処理されたアカゲザルは、7 dpiで安楽死させられた。 a、b、レムデシビル治療動物（a）および局所的に広範囲の硬化領域を有するビヒクル治療動物（b、円）の肺の代表的な背面図。組織学的分析は、治療群ごとに 6 匹の動物のそれぞれからの 6 つの肺葉からの 3 つの切片で実行され、c ～ h の代表的な画像が選択されました。 c、レムデシビル処置動物6匹中3匹で最小限の胸膜下間質性肺炎（ボックス）が観察された。ｄ、ビヒクル処置動物６匹中５匹で浮腫を伴う中程度の胸膜下間質性肺炎（ボックス）が観察された。 e、cの四角で囲った領域。II型肺細胞（矢印）で囲まれた肺胞と泡状マクロファージを含む肺胞腔（矢印）。 f、浮腫および適度な数のマクロファージおよび好中球によって拡張された肺間質を含む、dの四角で囲った領域。肺胞は II 型肺細胞によって裏打ちされています (矢印)。肺胞腔は浮腫 (星印) と少数の肺マクロファージ (矢印) で満たされています。 g、レムデシビルで治療した動物のI型肺細胞（矢印）およびII型肺細胞（矢印）中のウイルス抗原。 h、ビヒクル処理動物のI型肺細胞（矢印）およびマクロファージ（矢印）におけるウイルス抗原。スケールバー: c、d、200 μm。 e-h、20μm。

私たちは、すべてのレムデシビル治療動物およびビヒクル治療対照からのサンプルに対してディープシーケンシングを実行することに成功しました。コロナウイルスにレムデシビルに対する耐性を与える RNA 依存性 RNA ポリメラーゼの既知の変異 11 は、試験したどのサンプルでも検出されませんでした (補足表 1)。

私たちの知る限り、レムデシビルは、新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の動物モデルにおいて、SARS-CoV-2に対する有効性が証明された最初の抗ウイルス治療薬です。 SARS-CoV-2に感染したアカゲザルをレムデシビルで治療すると、臨床疾患と肺への損傷が減少した。アカゲザルに使用されるレムデシビルの用量は、ヒトに使用されるものと同等です。しかし、アカゲザルの病気は急性であるため、治療のタイミングをヒトの対応する病気の段階に直接当てはめることは困難です。私たちの研究では、気管支肺胞洗浄液中のウイルス量によって示される肺内でのウイルス複製のピーク近くに治療が投与され、臨床症状とウイルス複製に対する治療の最初の効果が12時間以内に観察されました。急性ウイルス性気道感染症に対する直接作用型抗ウイルス薬の有効性は、通常、治療開始が遅れると低下します12。したがって、最大限の治療効果を達成するには、新型コロナウイルス感染症患者においてレムデシビル治療をできるだけ早期に開始する必要があります。

レムデシビルで治療した動物の肺では、明らかな呼吸器症状が見られず、ウイルスの複製が減少したにもかかわらず、ウイルスの排出は減少しませんでした。この発見は患者管理にとって非常に重要であり、臨床的改善は感染性の欠如として解釈されるべきではありません。我々は、レムデシビルの代謝産物が下気道で見つかることを示しましたが、上気道での薬物レベルは特徴づけられておらず、上気道への分布を改善し、それによって放出を減らすために薬物送達の代替経路を備えた新規製剤を考慮する必要があります。そして潜在的な感染リスク。しかし、重篤な新型コロナウイルス感染症は肺のウイルス感染に起因するため、この臓器がレムデシビル治療の主な標的となっている。感染したアカゲザルの肺におけるレムデシビルの生物学的利用能と保護効果は、レムデシビルによる新型コロナウイルス感染症患者の治療をサポートする。重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-1913）患者を対象としたある臨床試験では、レムデシビル治療は臨床症状の改善をもたらさなかった。しかし、より多くの患者を対象とした別の臨床試験では、レムデシビル治療により、標準治療のみを受けた患者よりも改善までの時間が短縮されることが示されました14。アカゲザルでの我々の発見は、新型コロナウイルス感染症患者の肺炎への進行を防ぐために、臨床的に可能な限り早期にレムデシビル治療を考慮すべきであることを示している。

すべての動物実験は、NIH ロッキーマウンテン研究所の施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物管理評価認定協会 (AAALAC) 国際認定施設の認定スタッフによって、施設のガイドラインに従って実施されました。動物の使用は、実験動物の管理と使用に関する NIH ガイド、動物福祉法、米国農務省および実験動物の人道的な管理と使用に関する米国公衆衛生局の政策のガイドラインと基本原則に従ってください。アカゲザルは、明暗サイクルが固定された（12時間明期-12時間暗期）気候制御された室内で、社会的相互作用を可能にする隣接する個別の霊長類ケージに収容された。実験中、動物は少なくとも 1 日 2 回監視されました。市販のサルの餌、おやつ、果物が訓練を受けた職員によって 1 日 2 回提供されました。水は自由に摂取させた。環境エンリッチメントは、さまざまな人間の交流、マニピュランダ、商用玩具、ビデオ、音楽で構成されていました。施設内バイオセーフティ委員会 (IBC) は、BSL3 条件下での感染性 SARS-CoV-2 株の研究を承認しました。サンプルの不活化は、高密封容器からのサンプルの取り出しに関する IBC 承認の標準操作手順に従って実行されました。

SARS-CoV-2 疾患の転帰に対するレムデシビル治療の効果を評価するために、一過性の下気道疾患を引き起こす最近確立された SARS-CoV-2 感染のアカゲザルモデルを使用しました9。これは事前データがほとんどないモデルであるため、グループサイズを決定するための検出力分析を実行することはできませんでした。したがって、サンプルサイズは、呼吸器疾患の他の非ヒト霊長類モデル、主に MERS-CoV のアカゲザルモデルでの経験に基づいており、n = 6 で統計的有意性が得られました。 12匹の動物をランダムに2つのグループに割り当て、前述のように総用量2.6×106 TCID50（組織培養感染量の50％）のSARS-CoV-2株nCoV-WA1-2020を鼻腔内、経口、眼球および気管内経由で接種した。ルート。治療用レムデシビル治療の有効性は、成体アカゲザル6頭（雄3頭、雌3頭、それぞれ体重3.6～5.7kg）からなる2つのグループで試験された。アカゲザルにおけるSARS-CoV-2モデルの急性の性質のため、治療処置はSARS-CoV-2接種の12時間後に開始され、1日1回6dpi継続された。アカゲザルの1つのグループは、負荷用量10 mg/kgのレムデシビルで治療され、続いて毎日の維持用量5 mg/kgで治療されました。６匹の動物からなる他のグループは感染対照として機能し、等用量（すなわち、負荷用量２ｍｌ／ｋｇ、その後は１ｍｌ／ｋｇ）のビヒクル溶液（水および塩酸中の１２％スルホブチルエーテル－β－シクロデキストリン）を投与された。、pH 3.5）、同じ治療スケジュールに従って。アカゲザルにおけるこの投与計画は、新型コロナウイルス感染症患者を対象とした臨床研究で試験された毎日の投与量を模倣しており、同様の全身薬物曝露をもたらします。治療は、左または右の橈側静脈または伏在静脈に交互に投与される静脈内ボーラス注射（約5分間にわたって送達される総用量）として送達された。ここでアカゲザルに使用されたレムデシビル治療コースは、患者における標準的な10日間の治療コースよりも短いですが、この短い治療コースは、肺浸潤および間質性肺炎がまだ存在するであろう接種後の時点で肺の病理を評価できるように選択されました。臨床試験からの最近のデータは、新型コロナウイルス感染症 (COVID-1914) 患者において、5 日間の治療コースが 10 日間の治療コースと同様の臨床上の利点があることを示しています。

前述の標準化されたスコアシートを使用して、動物の疾患の臨床徴候を 1 日 2 回観察しました9。動物のグループ割り当てを知らされていない同じ人物が、研究全体を通して動物を評価しました。この実験の所定のエンドポイントは 7 dpi でした。治療投与中、鼻、喉、および直腸のスワブを毎日収集しました。臨床検査は、麻酔をかけた動物に対して 0、1、3、5、および 7 dpi で実施されました。試験当日には、体重、体温、パルスオキシメトリー、血圧、呼吸数などの臨床パラメータが収集され、胸部背腹部および側面部の X 線写真も収集されました。 X線写真は、動物のグループ割り当てを知らされていない臨床獣医師によって分析されました。 1、3、および7 dpiで、10 mlの滅菌生理食塩水を使用してBALを実行しました。 7 dpi で死亡した後、動物の剖検が行われました。肉眼的肺病変の割合は、動物のグループ割り当てを知らされていない委員会認定の獣医病理学者によってスコア付けされ、以下の組織のサンプルが収集されました：頸部リンパ節、結膜、鼻粘膜、中咽頭、扁桃腺、気管、すべての肺葉、縦隔リンパ節、左右の気管支、心臓、肝臓、脾臓、腎臓、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、膀胱。組織スライドの組織病理学的分析は、動物のグループ割り当てを知らされていない委員会認定の獣医病理学者によって行われました。

SARS-CoV-2 分離株 nCoV-WA1-2020 (MN985325.1)15 (Vero 継代 3) は疾病対策センター (CDC) のご厚意により提供され、ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、Sigma) 内の Vero E6 細胞で 1 回増殖しました。）２％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した（ウイルス分離培地）。使用したウイルスストックは、最初に寄託された GenBank 配列 (MN985325.1) と 100% 同一であり、夾雑物は検出されませんでした。 VeroE6細胞は、10%ウシ胎児血清、1mM l-グルタミン、50U/mlペニシリンおよび50μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で維持した。

レムデシビル (RDV; GS-5734) は、Gilead Sciences でプロセス化学部門 (カナダ、アルバータ州) により適正製造基準 (GMP) 条件下で製造されました。バッチ番号 5734-BC-1P を 12% スルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン水溶液に可溶化し、対応するビヒクル溶液を NIH に提供しました。

トリブチルアミンは、Millipore Sigma から購入しました。 LC-MS グレードの水、アセトン、メタノール、イソプロパノール、酢酸は、Fisher Scientific から購入しました。分子分析用のすべての合成標準は、Gilead Sciences Inc. によって提供されました。血清および清澄な肺ホモジネートは、分析前にこれらのサンプル中に潜在的に存在する感染性ウイルスを不活化するためにガンマ線照射 (2 MRad) されました。血清または清澄肺ホモジネートのいずれかのアリコート50μlを、氷上で50％アセトン、35％メタノール、15％水（v/v）950μlで希釈することにより、小分子分析用のサンプルを調製した。サンプルを室温で 15 分間インキュベートし、その後 16,000g で 5 分間遠心分離しました。清澄化した上清（８５０μｌ）を回収し、ＳａｖａｎｔＤＮＡ１２０ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で乾燥させた。サンプルを100μlの50%メタノール、50%水(v/v)に再懸濁し、前と同様に遠心分離した。上清を LC-MS 分析のためにサンプルバイアルに移しました。サンプルは、Sciex ExionLC AC システムでイオンペア液体クロマトグラフィー戦略を使用して分離されました。サンプルを Waters Atlantis T3 カラム (100 Å、3 μm、3 mm × 100 mm) に注入し、2% イソプロパノール中の 5 mM トリブチルアミン、5 mM 酢酸、5% メタノール、93% 水からの二成分勾配を使用して溶出しました ( v/v) を 5.5 分かけて 100% イソプロパノールに加えます。分析物は、Sciex 5500 QTRAP 質量分析計をネガティブモードで使用して測定しました。各分析物について 2 つのシグナルペアを使用して多重反応モニタリングを実行し、トリガーされたプロダクトイオンスペクトルを収集し、合成的に純粋な標準のスペクトルと比較することによってシグナル忠実度を確認しました。

すべての分析対象物は、ターゲットマトリックス (つまり、血清または透明な肺ホモジネート) で調製されたそれぞれの合成標準の 8 点検量線に対して定量化され、実験サンプルと同じ方法で処理されました。定量限界 (LOQ) は、信号対雑音比 10 で概算されました。各マトリックス中の測定分子の LOQ は、肺ホモジネートと血清の両方で GS-441524 については 5 nM、肺ホモジネートと血清の両方で GS-704277 については 1 nM でした。血清中の GS-5734 は 0.08 nM。組織溶解中の肺ホモジェネート中の GS-5734 および三リン酸化ヌクレオチド代謝産物の不安定性により、肺組織におけるこれらの代謝産物の検出が妨げられました。

製造業者の指示に従ってQiaAmp Viral RNAキット(Qiagen)を使用して、RNAをスワブおよびBALから抽出した。組織（３０ｍｇ）をＲＬＴ緩衝液中でホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してＲＮＡを抽出した。ウイルス RNA の検出には、メーカーの説明書に従って Rotor-Gene プローブキット (Qiagen) を使用したワンステップリアルタイム RT-PCR E アッセイ 16 で 5 μl RNA を使用しました。各実行では、液滴デジタル PCR によってカウントされた RNA 標準の標準希釈を並行して実行し、サンプル内のコピー数を計算しました。

ウイルス滴定は、Vero E6 細胞におけるエンドポイント滴定によって実行されました。組織を、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して１ｍｌのＤＭＥＭ中で均質化した。細胞には、綿棒および BAL サンプルの 10 倍連続希釈液を接種しました。ウイルス単離は、肺組織を１ｍｌのＤＭＥＭ中でホモジナイズし、２５０μｌの清澄なホモジネートおよびその１：１０希釈物を２４ウェルプレート中のＶｅｒｏＥ６細胞に接種することによって行った。細胞の接種から１時間後、接種材料を除去し、１００μｌ（ウイルス滴定）または５００μｌのウイルス分離培地と交換した。接種の６日後、ＣＰＥをスコア化し、ＴＣＩＤ５０を計算した。

アカゲザル組織に対して組織病理学および免疫組織化学を実施した。 10% 中性緩衝ホルマリン中で最低 7 日間固定し、パラフィンに包埋した後、組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色しました。 SARS-CoV-2 抗原を検出するために、SARS-CoV-2 N に対するカスタムメイドのウサギ抗血清を 1:1,000 希釈で使用して免疫組織化学を実施しました。染色されたスライドは、認定獣医病理学者によって分析されました。

ウイルスRNAを上記のように抽出しました。 cDNA は記載どおりに調製しましたが、若干の変更を加えました 17。簡単に説明すると、Ribo-Zero Gold H/M/R (Illumina) を使用して 3 ～ 12 μl の抽出 RNA から rRNA を除去し、次にランダムヘキサマーと SuperScript IV (ThermoFisher Scientific) を使用して逆転写しました。 RNaseH 処理後、Klenow フラグメント (New England Biolabs) を使用して第 2 鎖合成を実行し、得られた二本鎖 cDNA を RiboShredder RNase Blend (Lucigen) と RNase、DNase フリー、高濃度の RNase (Roche Diagnostics、インディアナポリス) の組み合わせ混合物で処理しました。、ＩＮ）、次いで、ＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ精製（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。 KapaのHyperPlusライブラリー調製キット(Roche Sequencing Solutions)を使用して、二本鎖cDNAから配列決定ライブラリーを調製した。多重化を容易にするために、メーカーのマニュアルに従って、KAPA Unique Dual-Indexed Adaptors を使用してアダプターライゲーションを実行し、KAPA HiFi HotStart Ready mix と 7 回の PCR 増幅サイクルを使用してアダプターライゲーション産物のサンプルを濃縮しました。 8 つのサンプルライブラリからなるプールを、myBaits Expert Virus SARS-CoV-2 パネルを使用し、メーカーのマニュアルバージョン 4.01 に従い、14 サイクルのポストキャプチャ PCR 増幅 (Arbor Biosciences) を使用してハイブリッドキャプチャウイルス濃縮に使用しました。精製され、濃縮されたライブラリーは、Kapa Library Quantification キット (Roche Sequencing Solutions) を使用して定量され、Illumina NextSeq 550 機器 (Illumina) で 2 × 150 塩基対のリードとして配列されました。

生の fastq リードは、cutadapt バージョン 1.1218 を使用して Illumina アダプター配列をトリミングし、次に FASTX-Toolkit (Hannon Lab) を使用して品質を確保するためにトリミングおよびフィルター処理しました。残りのリードは、パラメータ --local --no-mixed -X 1500 を指定した Bowtie2 バージョン 2.2.919 を使用して、SARS-CoV-2 2019-nCoV/USA-WA1/2020 ゲノム (MN985325.1) にマッピングされました。PCR 重複は削除されました。 picard MarkDuplicates (Broad Institute) を使用し、パラメータ -ploidy 2 を指定した GATK HaplotypeCaller バージョン 4.1.2.020 を使用してバリアントを呼び出しました。バリアントは、bcftools を使用して QUAL >1000 および DP >20 についてフィルターされました。

統計分析は、GraphPad Prism ソフトウェアバージョン 8.2.1 を使用して実行されました。

研究デザインの詳細については、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary を参照してください。

この原稿に含まれるすべてのデータは Figshare (https://doi.org/10.35092/yhjc.12111570) に保管されています。配列は、BioProject 受託番号 PRJNA632475 で NCBI に寄託されています。

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